M2型巨噬細(xì)胞在小腸放射損傷修復(fù)中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、放射治療是當(dāng)今腫瘤治療的三大手段之一，在病人術(shù)前或是術(shù)后放療可以有效治愈腫瘤，減少腫瘤復(fù)發(fā)概率。但是腹部和盆腔腫瘤在放射治療過(guò)程中，放射性腸損傷是一重要的臨床問(wèn)題。放射性腸損傷是由于腸上皮放射敏感性較高，受照小腸或是結(jié)直腸損傷誘發(fā)的腸道反應(yīng)，常常會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉和營(yíng)養(yǎng)吸收障礙，體重下降，甚至出現(xiàn)便血、腸梗阻、腸簍等病變，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，不利于放療對(duì)腹盆腔腫瘤的控制。
　　哺乳類動(dòng)物腸上皮是由單層柱狀上皮組成，主

2、要分為兩個(gè)不同部分：分化區(qū)和增生區(qū)，分化的上皮細(xì)胞主要存在于絨毛和上皮表面，增生上皮細(xì)胞主要位于隱窩，可以進(jìn)一步的分為干細(xì)胞和TA細(xì)胞，TA細(xì)胞具有快速分化并轉(zhuǎn)移到增生區(qū)，干細(xì)胞又能及時(shí)補(bǔ)充TA細(xì)胞，因此在增生區(qū)連續(xù)不斷地分化會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞沿隱窩-絨毛軸方向移動(dòng)，逐漸移動(dòng)到分化區(qū)，并使上皮細(xì)胞分化為吸收細(xì)胞系（腸細(xì)胞）和分泌細(xì)胞系（杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞）。所以認(rèn)為腸上皮是由四種腸道上皮細(xì)胞系組成，它們都起源于干細(xì)胞，并且位于隱窩基底部的

3、干細(xì)胞在維持腸上皮平衡起到重要作用1-2。像是腸道感染、放射損傷和特發(fā)性腸炎等各種各樣疾病引起的腸上皮損傷就會(huì)造成上皮細(xì)胞的凋亡、上皮屏障的破壞3。上皮層受到損傷，就會(huì)逐步激活再生程序，隱窩干細(xì)胞增殖，并移動(dòng)到分化區(qū)，使上皮層恢復(fù)連續(xù)緊密的結(jié)構(gòu)4。那么分化區(qū)凋亡的上皮距離隱窩干細(xì)胞甚遠(yuǎn)，如何及時(shí)通知到干細(xì)胞呢？巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的組成部分，在體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群之一就是腸道巨噬細(xì)胞5，它們位于上皮屏障下方，參與腸道的免疫應(yīng)答，但目前

4、原代培養(yǎng)存在困難。Tanja等認(rèn)為巨噬細(xì)胞這種免疫應(yīng)答激活不僅僅是由于外來(lái)物質(zhì)的刺激，還有上皮參與，所以他們進(jìn)行了巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)，但是在共培養(yǎng)的第7天發(fā)現(xiàn)只有少量巨噬細(xì)胞存活; Hiroki等人研究巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間相互傳遞信號(hào)的機(jī)制，試通過(guò)體外培養(yǎng)Caco-2與THP-1，并沒(méi)有首選體內(nèi)腸巨噬細(xì)胞。
　　成熟的巨噬細(xì)胞在主要是來(lái)源于骨髓，隨著外周血液循環(huán)到達(dá)組織，組織的微環(huán)境可使巨噬細(xì)胞發(fā)生極化。目前巨噬細(xì)胞極化

5、類型主要分為兩種：M1型主要是參與免疫應(yīng)答，吞噬有害微生物等，產(chǎn)生炎癥因子IL-6、NO等，提高機(jī)體的防御，抵御有害物質(zhì)侵襲；M2型主要是在損傷組織中通過(guò)分泌抗炎因子參與修復(fù)與重塑，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)。
　　鑒于此，本論文首先對(duì)腸道自身的巨噬細(xì)胞進(jìn)行了極型鑒定，在體外模擬凋亡腸道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞極化，探索這種巨噬細(xì)胞對(duì)隱窩腸道干細(xì)胞的作用和機(jī)制，為放射損傷的小腸修復(fù)提供理論依據(jù)。
　　一、小鼠小腸內(nèi)巨噬細(xì)胞極型

6、和在放射損傷中的作用
　　目的：腸道巨噬細(xì)胞在放射損傷中的作用
　　方法：通過(guò)對(duì)對(duì)照組和2Gy、8Gy照射組照后72小時(shí)和96小時(shí)C57BL/6小鼠腸細(xì)胞的分離及利用流式細(xì)胞分選技術(shù)，得到小鼠腸道巨噬細(xì)胞；對(duì)小鼠腸道巨噬細(xì)胞抽提RNA，以IL-10和iNOS基因作為分型標(biāo)志物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以確定照射前后巨噬細(xì)胞極型；正常C57BL/6小鼠在第1天、5天、7天和9天分別經(jīng)腹腔注射200μl Clodronate

7、脂質(zhì)體、PBS脂質(zhì)體部分祛除小鼠腸道巨噬細(xì)胞，第8天和第11天進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠胸腺、淋巴、腸道、脾臟、骨髓CD68+細(xì)胞選取最佳祛除巨噬細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)；對(duì)照組與照射組小鼠均分別給予Clodronate脂質(zhì)體和PBS脂質(zhì)體，第8天小鼠進(jìn)行8Gy的全身照射并在照后72小時(shí)、96小時(shí)采腸道標(biāo)本，進(jìn)行 CD68、Claudin5免疫組織化學(xué)染色、HE染色、腸上皮核間距分析觀察小鼠腸道的放射損傷情況。
　　結(jié)果：對(duì)照組小鼠腸道巨噬細(xì)胞百

8、分?jǐn)?shù)是59.2％、60.6%、60.3%，2Gy照后72小時(shí)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)25.8%、33.7%、30.8%，巨噬細(xì)胞開始下降；96小時(shí)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)49.9%、44%、42.1%，逐漸恢復(fù)；8Gy照后72小時(shí)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)40.9%、36%、42.9%，96小時(shí)細(xì)胞百分?jǐn)?shù)40.2%、40.5%、39.3%，未見明顯恢復(fù)；RT-PCR結(jié)果表明對(duì)照組和照射組小鼠腸道的巨噬細(xì)胞均存在M2型巨噬細(xì)胞；小鼠腹腔注射 Clodronate脂質(zhì)體和PBS，發(fā)現(xiàn)

9、小鼠體內(nèi)胸腺、淋巴、腸道、脾臟、骨髓細(xì)胞巨噬細(xì)胞在給藥后的第8天CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量開始下降，在第11天進(jìn)一步下降，后期恢復(fù)到第8天水平，因此選取給藥后第11天作為祛除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞效果最佳時(shí)間點(diǎn)；病理分析顯示在給予小鼠8Gy照射后，巨噬細(xì)胞減少的小鼠腸道損傷較對(duì)照組更為明顯；核間距分析結(jié)果表明8Gy照射后72h對(duì)照組上皮細(xì)胞核排列較對(duì)照組排列較為紊亂，Clodronate脂質(zhì)體組上皮細(xì)胞核排列更加紊亂，核間距增大，出現(xiàn)核固縮壞死；9

10、6h對(duì)照組上皮逐漸開始恢復(fù)，增生，核排列較72 h緊密，形態(tài)相對(duì)完整，96hClodronate脂質(zhì)體組上皮損傷更為嚴(yán)重，核間距進(jìn)一步增加；Claudin5結(jié)果顯示8Gy照射后72h對(duì)照組與Clodronate脂質(zhì)體組均存在部分屏障損傷，未見明顯差異，96h對(duì)照組部分損傷，Clodronate脂質(zhì)體組腸道組織大體存在明顯損傷，其損傷程度明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：在小鼠腸道內(nèi)巨噬細(xì)胞是以M2型存在，而且在照射后極型不改變，并在腸道

11、放射性損傷中起保護(hù)作用。
　　二、體外誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)Lgr5腸道干細(xì)胞增殖
　　目的：腸道巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制
　　方法：對(duì) CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行6Gy和15Gy照射并用流式細(xì)胞儀通過(guò)磷脂酰絲氨酸外翻法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用凋亡細(xì)胞上清液對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行體外極化誘導(dǎo)分型，通過(guò)Elisa分析IL-10與IL-12的變化確定細(xì)胞體外極化誘導(dǎo)后的極型；利用Lgr5-EGFP-IRES-creER

12、T2小鼠進(jìn)行Lgr5腸道干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)；將體外誘導(dǎo)極化的RAW264.7巨噬細(xì)胞與 Lgr5腸道干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)或Transwell培養(yǎng)，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度。
　　結(jié)果： CT26細(xì)胞在15Gy照射條件下在72小時(shí)凋亡細(xì)胞率達(dá)到66.9%；RAW264.7細(xì)胞在凋亡上清液的作用三天后細(xì)胞IL-10表達(dá)上調(diào)以及IL-12表達(dá)下調(diào)，證實(shí)RAW264.7發(fā)生極化成為M2型巨噬細(xì)胞；Lgr5+腸道干細(xì)胞在分別缺少N

13、oggin、EGF、R-spondin干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的條件下與對(duì)照組RAW264.7、M2型RAW264.7分別共培養(yǎng)，表明M2型巨噬細(xì)胞可以分泌EGF因子，代替培養(yǎng)基中的EGF，促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。
　　結(jié)論： M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌EGF促進(jìn)Lgr5+腸道隱窩干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。
　　綜上所述表明腸道中存在M2型巨噬細(xì)胞，這種極型不因照射而改變，并且通過(guò)分泌EGF因子，促進(jìn)腸道隱窩干細(xì)胞Lgr5生長(zhǎng)增殖。腸道中M2型巨噬