MNNG誘導人核糖核苷酸還原酶小亞基RRM2-p53R2基因轉錄機制的研究.pdf

1、MNNG作為一種單功能烷化劑，被認為是環(huán)境中廣泛存在的化學致癌物。其可以導致DNA斷裂、基因突變甚至腫瘤的發(fā)生。MNNG誘導的DNA損傷反應可以激活許多修復相關基因。核糖核苷酸還原酶（RNR）催化核糖核苷二磷酸還原為脫氧核糖核苷二磷酸，在DNA合成和修復過程中起重要作用。人核糖核苷酸還原酶由兩個相同的大亞基（RRM1）和兩個相同的小亞基（RRM2或p53R2）組成兩種RR酶，即RRM1-RRM2和RRM1-p53R2。那么MNNG是否可

2、以影響細胞中RRM2或p53R2的表達水平，以及通過何種途徑影響至今沒有相關報道。
　　本文研究了MNNG誘導RRM2和p53R2轉錄上調的作用和機制。(1)我們發(fā)現MNNG可以通過轉錄調控途徑誘導RRM2和p53R2基因表達上調，但不影響RRM1的表達水平。而且，MNNG不僅可以誘導RRM2/p53R2的轉錄上調，同時也導致了它們的核轉位。(2)通過檢測MNNG處理前后p-H2AX水平，細胞周期分布及細胞凋亡比例，我們發(fā)現RRM

3、2主要參與MNNG誘導的DNA損傷修復過程，而p53R2的作用相對較弱。(3)通過DNA pull-down偶聯LC-MS/MS篩選、以及ChIP-qPCR和免疫印跡法驗證，我們發(fā)現MNNG處理KB細胞后，轉錄因子E2F3、E2F1及NFY結合到RRM2啟動子。結合位點鄰近于E2F結合序列的NFY可以加強E2F3和E2F1結合到RRM2啟動子上。通過使用免疫共沉淀技術分析發(fā)現NFY與E2F3在細胞內存在相互作用。報告基因實驗結果顯示相較

4、于E2F1，E2F3可以顯著激活RRM2的啟動子報告基因活性。在KB細胞系中，過表達E2F3能夠增加RRM2的表達，從而降低MNNG誘導的p-H2AX水平。通過小RNA干擾E2F3可以有效抑制MNNG誘導的RRM2表達上調，進而增強p-H2AX水平。(4)有趣的是，MNNG主要通過翻譯后修飾導致E2F3水平上調。同時，我們也發(fā)現MNNG可以快速誘導NFYA和NFYB mRNA水平的上調。上調的NFY入核與E2F3聯合調控RRM2的轉錄。

5、(5)為了進一步探究E2F3表達上調的分子機制，我們研究了E2F3上游可能的信號激酶。結果顯示MNNG是通過激活ATR-CHK1-E2F3信號通路上調E2F3蛋白水平，從而轉錄激活RRM2基因，參與DNA修復。對于p53R2，我們發(fā)現MNNG誘導其轉錄上調不僅依賴于p53，同時也依賴于E2F1。而MNNG誘導的RRM2轉錄上調主要依賴于E2F3和NFY。
　　綜上所述，本文結果表明RNR參與化學致癌物MNNG誘導的DNA損傷修復，