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文檔簡介
1、研究背景:
核苷酸還原酶可催化二磷酸核苷轉(zhuǎn)變成脫氧二磷酸核苷,進一步提供三磷酸脫氧核苷,是DNA合成和復制過程中必不可少的限速酶。RR全酶結(jié)構(gòu)包括大亞基α和小亞基β,形成α2β2的異四聚體結(jié)構(gòu)后方具備活性。在人體中,一個大亞基RRM1和2個小亞基已經(jīng)鑒定出來。大亞基RRM1包括底物和變構(gòu)效應物位點,調(diào)控RR全酶的活性及參與底物的還原。新近克隆出的p53R2基因是RR家族的新成員,與RRM2有80%的同源性。在紫外線、γ射線
2、或是阿霉素刺激后,在p53誘導下,細胞內(nèi)p53R2表達上升,與RRM1形成RR全酶,提供dNTPs,直接參與DNA的修復。
研究發(fā)現(xiàn):敲除p53R2基因的小鼠在8周時于腎臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細胞,在14周時死于嚴重的腎衰竭。其他一項對兒童線粒體耗竭綜合癥患者的研究發(fā)現(xiàn):p52R2的突變與肌肉中線粒體DNA的含量耗竭直接相關(guān)。以上研究提示:當細胞處于休眠期時,以p53R2/RRM1為核心的核苷酸還原酶在線粒體DNA的合成過程中
3、起重要的作用。雖然在非增生期的細胞中可通過線粒體內(nèi)脫氧鳥苷激酶和胸苷激酶的補救合成途徑來合成dNTPs,兩種酶中任何一種突變都會造成線粒體DNA的耗竭并引起嚴重的疾病。但此時僅僅通過補救合成途徑來提供dNTPs是遠遠不夠的,同樣需要p53R2催化的核苷酸還原作用。迄今為止,對p53R2如何影響線粒體DNA的合成,p53R2是否聚集于線粒體內(nèi)以及p53R2是否影響線粒體的功能依舊知之甚少。
在潰瘍性結(jié)腸炎的研究中發(fā)現(xiàn):破壞p
4、53-p53R2介導的DNA修復系統(tǒng)會導致結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。p53R2表達受抑制后,經(jīng)紫外線的刺激,發(fā)現(xiàn)TK6細胞內(nèi)的突變率上升了3倍。而我們先前在大腸癌中的研究表明:p53R2表達水平和腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。在另一方面,抑制p53R2表達可增加KB,PC-3,HSC-3及Ca9-22腫瘤細胞的侵襲能力。因此,p53R2在惡性腫瘤中的作用可能與RRM2相反,對腫瘤的增生及轉(zhuǎn)移有潛在的抑制作用。但迄今為止,p53R2表達水平與大腸癌的預
5、后是否相關(guān)仍不清楚。
研究目的:
明確p53R2是否影響KB及PC3細胞中線粒體DNA的拷貝數(shù)及線粒體的dNTP庫;研究p53R2是否聚集于KB及PC3細胞線粒體中;探索KB及PC3細胞線粒體中是否有RR活性;研究p53R2是否影響KB及PC3細胞中線粒體的功能;判斷p53R2是否可影響大腸癌的預后。
研究內(nèi)容:
第一部分:p53R2聚集于KB及PC3細胞線粒體中并影響線粒體功能<
6、br> 第一章:在KB和PC3細胞系中,p53R2表達水平與線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體數(shù)量呈正相關(guān)
前述研究發(fā)現(xiàn)在人類及小鼠中,p53R2突變均可引起嚴重的線粒體DNA耗竭。為在腫瘤細胞系中進一步證實此結(jié)論,我們用p53R2 siRNA抑制p53R2的表達,48小時后用定量PCR的方法擴增線粒體基因COX-1并檢測線粒體DNA拷貝數(shù)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):抑制p53R2后,KB及PC3細胞內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)分別下降為41
7、.7%和34.9%。而用另一個線粒體基因ND1檢測也得到類似的結(jié)果,KB及PC3細胞內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)分別下降為30.1%和27.4%。為探索p53R2表達抑制后細胞內(nèi)線粒體數(shù)量的變化,我們用免疫電鏡觀察其變化。我們發(fā)現(xiàn):p53R2表達抑制后細胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯下降。以上結(jié)果說明在KB與PC3細胞系中,p53R2表達水平與線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體數(shù)量呈正相關(guān)。
第二章:p53R2聚集于KB及PC3細胞的線粒體中,通過線
8、粒體外膜轉(zhuǎn)位酶復合體轉(zhuǎn)運入線粒體內(nèi)
我們分離細胞漿和線粒體后,用Western blot的方法檢測p53R2在蛋白水平的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在線粒體成分中含有p53R2。為進一步證實此結(jié)果,我們用細胞色素C及p53R2抗體分別標記線粒體及p53R2,通過免疫熒光的方法觀察p53R2的定位,發(fā)現(xiàn)p53R2聚集于KB及PC3細胞的線粒體中。我們還用綠色熒光蛋白和線粒體示蹤劑分別標記p53R2和線粒體,通過共聚焦顯微鏡觀察p53R2與
9、線粒體的定位,同樣證實了前面的結(jié)果。定量分析結(jié)果顯示:p53R2與KB及PC3細胞中線粒體的重疊率分別為66.8%及61.2%。最后我們用免疫金標記p53R2后通過免疫電鏡觀察細胞的亞顯微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)KB及PC3細胞線粒體內(nèi)有p53R2顆粒的聚集。為探索p53R2是否動態(tài)存在于線粒體內(nèi),我們用無血清培養(yǎng)法同步細胞周期,隨后加入含10%血清的培養(yǎng)基后每隔2小時觀察細胞內(nèi)p53R2的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)的p53R2未發(fā)生明顯變化。說明p53
10、R2聚集于KB及PC3細胞線粒體內(nèi),但與細胞周期無直接關(guān)系。以上4種不同的實驗方法均證實p53R2聚集于KB及PC3細胞線粒體內(nèi),并于細胞周期無關(guān)。
幾乎所有的線粒體前體蛋白都是通過線粒體外膜轉(zhuǎn)運酶復合體轉(zhuǎn)運入線粒體內(nèi)。Tom40是TOM復合體的核心成分,是一個具有桶狀結(jié)構(gòu)的膜內(nèi)在蛋白質(zhì),可形成前體蛋白穿越的通道。我們用Tom40 siRNA抑制Tom40的表達水平后進一步檢測KB及PC3細胞線粒體內(nèi)p53R2的含量是否受
11、影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):抑制Tom40的表達后,線粒體內(nèi)p53R2含量也隨之降低,而細胞漿內(nèi)的p53R2水平?jīng)]有明顯變化。此結(jié)果說明p53R2通過TOM復合體轉(zhuǎn)運入線粒體內(nèi)。
第三章:線粒體內(nèi)不存在RR的活性,降低p53R2表達并未引起線粒體dNTP庫的顯著降低
為進一步探索線粒體中p53R2的作用,我們分別檢測了細胞漿和線粒體成分中RR的活性。和細胞漿中RR的活性相比,線粒體中幾乎測不到RR的活性。KB及PC3細胞
12、線粒體中RR的活性只有細胞漿中活性的4.96%及0.96%。由于RRM2或p53R2必需與RRM1形成具有四聚體結(jié)構(gòu)的RR全酶才具備核苷酸還原的活性。為了證實線粒體中不具備RR活性的原因,我們用Western blot的方法檢測RRM1是否在線粒體內(nèi)存在,結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體中不存在RRM1,這進一步證實了線粒體中不具備RR活性。
為研究p53R2對KB及PC3細胞內(nèi)線粒體dNTP庫的影響,我們用p53R2siRNA抑制p53R
13、2的表達,隨后檢測其變化。我們發(fā)現(xiàn):抑制p53R2表達后,KB細胞線粒體dATP、dTTP、dCTP、dGTP及總dNTP庫從7.3、12.6、21.8、11.9和53.6分別下降到5.8、11.4、20.5、7.9和45.6pmoles/百萬細胞。而PC3細胞線粒體dATP、dTTP、dCTP、dGTP及總dNTP庫從4.0、2.6、1.9、1.7及10.2分別下降至2.7、2.2、1.4、1.5及7.8pmoles/百萬細胞。但均未
14、見統(tǒng)計學意義。此研究說明:在正常狀態(tài)下的KB及PC3中,p53R2對細胞線粒體dNTP庫影響不大。此部分研究主要說明線粒體內(nèi)不存在RRM1,不具備RR的活性,提示線粒體內(nèi)的p53R2可能具有其他的功能。
第四章:p53R2影響KB及PC3細胞線粒體功能:包括線粒體膜電位,ATP合成及細胞色素C氧化酶活性等
我們用JC-1來檢測p53R2表達與線粒體膜電位的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):抑制p53R2后,代表受損線粒體的R1
15、比例明顯上升。在KB及PC3細胞中,R1比例分別從15.1%及16.1%上升至32.4%及27.1%。此研究說明p53R2的抑制可引起線粒體膜電位的破壞。同時,我們還檢測了細胞內(nèi)游離ATP的濃度和線粒體內(nèi)細胞色素C氧化酶活性的變化。我們發(fā)現(xiàn):p53R2表達降低后,KB及PC3細胞內(nèi)游離ATP濃度分別減少59.3%和62.82%。而細胞色素C氧化酶的活性則分別下降了88.8%和87.3%。說明p53R2可影響ATP的合成及細胞色素C氧化酶
16、的活性。
第二部分:p53R表達水平與大腸癌預后呈負相關(guān)
我們收集了浙江大學醫(yī)學院附屬二院1999-2004年間接受過大腸癌外科治療的220例病例資料。同時收集了美國City of Hope國家醫(yī)學中心107例大腸癌病例資料作為驗證。所以患者均接受定期隨訪。我們用免疫組化染色分析p53R2的表達情況。對浙江大學附屬二院220例樣本的單因素及多因素分析結(jié)果顯示:p53R2與腫瘤浸潤程度呈負相關(guān)。生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)
17、:p53R2表達水平與大腸癌患者的預后密切相關(guān),p53R2高表達提示良好的預后。進一步分析顯示:在Ⅲ-Ⅳ期大腸癌中,p53高表達與良性預后相關(guān),而在Ⅰ-Ⅱ期大腸癌中,p53表達水平與預后相關(guān)性不大。對City of Hope的Ⅳ期大腸癌樣本分析同樣證明此結(jié)論。同時,我們還發(fā)現(xiàn)p53陽性的病例中,p53R2表達與大腸癌預后呈負相關(guān);而p53陰性的病例中,p53R2表達與大腸癌預后無明顯相關(guān)性。
研究結(jié)論:
1.
18、在KB與PC3細胞系中,p53R2表達水平與線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體數(shù)量呈正相關(guān)。
2.p53R2聚集于KB及PC3細胞的線粒體中,通過線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶復合體轉(zhuǎn)運入線粒體內(nèi)。
3.在KB及PC3細胞線粒體內(nèi)不存在RR的活性,抑制p53R2表達水平并未明顯降低線粒體dNTP庫。
4.在KB與PC3細胞系中,p53R2的表達降低可抑制線粒體的功能:包括線粒體膜電位受損、ATP合成下降及細胞色素C氧
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