何首烏二苯乙烯苷抑制長波紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷.pdf

1、目的：探討二苯乙烯苷對(duì)長波紫外線(UVA)照射HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法從何首烏中提取二苯乙烯苷。UVA照射(18J/cm2)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT構(gòu)建體外細(xì)胞模型。MTT法測定細(xì)胞活力；酶生化法測定胞質(zhì)SOD，GSH-px活性及MBA水平；人氧化應(yīng)激與抗氧化PCR芯片檢測細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及抗氧化相關(guān)基因mRNA的變化，并通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。結(jié)果在18J/cm2UVA照射下，給定濃度范圍內(nèi)的二苯乙烯苷能劑量依

2、賴性提高胞質(zhì)SOD、GSH-px活力，降低胞質(zhì)MBA水平；基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷可明顯改變部分氧化應(yīng)激及抗氧化基因的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，基因芯片結(jié)果真實(shí)、可靠。結(jié)論二苯乙烯苷對(duì)UVA輻射HaCaT細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。其機(jī)制與清除自由基、提高抗氧化酶活性、改變相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。
　　 研究背景：
　　 自古以來，有關(guān)文獻(xiàn)記載的用作延緩衰老的中藥
　　 較多，如靈芝、人參、何首烏、綠茶

3、、銀杏等，已廣泛用于對(duì)抗機(jī)體衰老。但人們對(duì)這些藥物在延緩衰老方面的認(rèn)識(shí)多基于宮廷秘方、古書所傳而做出的推論和假設(shè)，科學(xué)依據(jù)不足。部分研究發(fā)現(xiàn)，其功能可能主要基于多種生物活性成分，如多糖、黃酮、微量元素、維生素、植物激素等，這些成分具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，參與DNA和蛋白質(zhì)合成與代謝，及抗氧化等作用。
　　 何首烏是一味古老的中藥，我國把何首烏用于強(qiáng)身鍵體、延年益壽已有一千多年的歷史。國外研究發(fā)現(xiàn)何首烏具有抗炎活性[1]。近年來國內(nèi)研究

4、發(fā)現(xiàn)，何首烏在抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗菌、造血和改善心血管功能等方面有許多獨(dú)到之處，隨即引起人們的廣泛關(guān)注。何首烏中含有多種生物活性成分，如葸醌類、二苯乙烯類和磷脂類化合物等[2]。其中二苯乙烯苷具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防治動(dòng)脈硬化及保肝等作用[3]。
　　 何首烏抗衰老作用的機(jī)制研究已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展：體外實(shí)驗(yàn)證明其具有抗氧化作用[4]，清除自由基[5]，修復(fù)損傷基因，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，以及延緩細(xì)胞衰老的作用

5、[6]。亞急性衰老動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)何首烏具有抗氧化[7]，調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)[8]，以及抗衰老作用][9]。既往的研究表明二苯乙烯苷具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用，本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞抗氧化酶活性、脂質(zhì)氧化水平及氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，以闡明二苯乙烯苷對(duì)長波紫外線照射角質(zhì)形成細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制，為其進(jìn)一步成為潛在的光保護(hù)成分并應(yīng)用于光保護(hù)制劑提供一定的理論依據(jù)。
　　 研究目的：
　　

6、第一部分：通過形態(tài)學(xué)觀察、MTT法及酶生化法檢測，研究不同濃度的二苯乙烯苷對(duì)UVA誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響。觀察二苯乙烯苷對(duì)UVA誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　 第二部分：采用人氧化應(yīng)激與抗氧化PCR芯片(RT2 ProfilerTM PCR Array)檢測二苯乙烯苷作用于UVA誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞后相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，從基因水平分析二苯乙烯苷可能的抗光老化作用機(jī)理；并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)芯片結(jié)

7、果進(jìn)行定量驗(yàn)證分析。
　　 研究方法：
　　 第一部分：培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞(人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞)，取指數(shù)生長期細(xì)胞分為6組，即：空白對(duì)照組、UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、UVA+1mmol/L TSG組、UVA+0.1mmol/L TSG組、UVA+0.01mmol/L TSG組、UVA+0.001mmol/L TSG組，每組4個(gè)復(fù)孔。UVA照射前12 h加入TSG孵育，照射前倒去培養(yǎng)基，PBS液沖洗三次，加入PBS液后UVA照射

8、，強(qiáng)度為18J/cm2。照射后細(xì)胞繼續(xù)用含有相應(yīng)濃度TSG的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)的變化；并用四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT法)檢測細(xì)胞存活和生長情況。培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，取指數(shù)生長期細(xì)胞分為6組，即空白對(duì)照組、UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、UVA+1mmol/L TSG組、UVA+0.1mmol/LTSG組、UVA+0.01mmol/L TSG組、UVA+0.001mol/L TSG組，每組3個(gè)復(fù)孔。UVA照射前12 h加入TSG孵育，

9、照射前倒去培養(yǎng)基，PBS液沖洗三次，加入PBS液后UVA照射，強(qiáng)度為18J/cm2。照射后細(xì)胞繼續(xù)用含有相應(yīng)濃度TSG的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后通過酶生化學(xué)檢測，測定細(xì)胞內(nèi)MDA含量和S01D、GSH-P X活性。
　　 第二部分：培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，取指數(shù)生長期細(xì)胞分為2組(三個(gè)重復(fù))，即UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、UVA+1mmol/L TSG組。UVA照射前12 h加入TSG孵育，照射前倒去培養(yǎng)基，PBS液沖洗三次，加入PBS液后UVA照

10、射，強(qiáng)度為18J/cm2。照射后細(xì)胞繼續(xù)用含有相應(yīng)濃度TSG的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后進(jìn)行檢測。收集細(xì)胞進(jìn)行RNA抽提、純化、質(zhì)量檢測，用人氧化應(yīng)激與抗氧化PCR芯片，檢測2組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)差異，以觀察二苯乙烯苷對(duì)UVA誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的作用。根據(jù)芯片結(jié)果，選出2條表達(dá)差異較大且與皮膚氧化應(yīng)激相關(guān)的基因，即基因GSR、TXNRD1，加之1條管家基因GAPDH作為校正基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，對(duì)PCR芯片結(jié)

11、果給予驗(yàn)證。
　　 研究結(jié)果：
　　 第一部分：倒置顯微鏡下觀察，UVA模型組細(xì)胞增殖速度明顯降低，培養(yǎng)液中碎片增多，少數(shù)細(xì)胞呈皺縮狀甚至胞體變小，胞質(zhì)內(nèi)有空泡形成，顆粒增多。UVA+二苯乙烯苷各濃度組，雖然與空白對(duì)照組相比也可見部分細(xì)胞碎片，少數(shù)胞質(zhì)內(nèi)有空泡形成，但與UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比明顯減少?？瞻讓?duì)照組僅有較少的細(xì)胞碎片，總體生長良好。MTT法檢測結(jié)果顯示，空白對(duì)照組OD值最高，與UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比P值＜0.05

12、，說明細(xì)胞存活率高于UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。UVA+二苯乙烯苷各濃度組與空白對(duì)照組相比P值＞0.05，說明UVA+二苯乙烯苷各濃度組的細(xì)胞存活率與UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比雖有數(shù)值上的上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 與空白對(duì)照組相比，UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的SOD、GSH-PX活性明顯降低(P值均＜0.05)，MDA含量顯著增高(P＜0.05)；UVA+二苯乙烯苷各濃度組的SOD、GSH-PX的活性降低，MDA含量則增高(P＜0.05)。而UVA+

13、二苯乙烯苷各濃度組與UVA實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，SOD、GSH-PX活性升高(P＜0.05)，MDA含量減少(P＜0.05)。
　　 第二部分：最有效濃度的二苯乙烯苷(1mmol/L)作用于UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞，在所檢測的89條人類氧化應(yīng)激與抗氧化相關(guān)基因中，共有17條基因熒光信號(hào)強(qiáng)度ratio值變化在2倍以上，為差異表達(dá)基因。其中16條基因的(干預(yù)組/對(duì)照組)ratio值＞2，為上調(diào)基因；而1條基因的(干預(yù)組/對(duì)照組)rati

14、o值＜0.5，為下調(diào)基因。依芯片結(jié)果選出2條表達(dá)差異較大且與皮膚氧化應(yīng)激相關(guān)的基因GSR、TXNRD1。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測干預(yù)組與對(duì)照組的2條基因(三組重復(fù))，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與基因芯片方法檢測結(jié)果的總體趨勢一致。
　　 結(jié)論：
　　 第一部分：二苯乙烯苷對(duì)于UVA照射HaCaT細(xì)胞的生長有一定促進(jìn)作用，但對(duì)細(xì)胞存活率影響不大。二苯乙烯苷對(duì)SOD、GSH-PX抗氧化酶的活性有一定增加作用；同時(shí)對(duì)抗UVA

15、誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用，從而減少細(xì)胞的MDA含量。故其能保護(hù)細(xì)胞免受UVA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。
　　 第二部分：二苯乙烯苷通過影響氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，特別是上調(diào)了ALOX12、ANGPTL7、AOX1、APOE、CSDE1、GLRX2、GSR、NOS2A、OXR1、PRDX3、PRNP、SCARA3、SEPP1、SFTPD、TTN、TXNRD1抗氧化基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。RT-PCR方法對(duì)