紫外線抑制樹突狀細(xì)胞分化的機(jī)制.pdf

1、第一部分，ERK1/2MAPK和p38MAPK通路在iC3b結(jié)合的單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化過程中的作用
　　目的:研究補(bǔ)體iC3b對(duì)人血前體單核細(xì)胞(Mo)分化的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證UVB誘導(dǎo)的補(bǔ)體iC3b沉積和CD1a+樹突狀細(xì)胞(DC)消失之間的關(guān)系;探討ERK1/2(ERK44/42)MAPK和p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑是否參與此影響,相應(yīng)的MAPK抑制劑是否能逆轉(zhuǎn)這種影響;經(jīng)iC3b及ERK1/2特異性抑制劑或p38特異性抑制

2、劑預(yù)處理后的Mo對(duì)CD4+T細(xì)胞的作用是否與正常情況下分化的Mo不同。
　　方法:1)從健康人外周血通過免疫磁珠法分離前體Mo。EAiC3b(IgM-plusiC3b-coatedsheeperythrocyte,IgM以及iC3b包被的羊紅細(xì)胞)與人血前體Mo以及IL-4、GM-CSF共同培養(yǎng)2天,并與EA(IgMcoatedsheeperythrocyte,IgM包被的羊紅細(xì)胞)作對(duì)照,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EAiC3b對(duì)前體Mo分

3、化的影響(CD14+,CD1a+);Westernblot檢測(cè)磷酸化ERK1/2、p38MAPK的蛋白水平,ELISA法檢測(cè)IL-10、IL-12p70水平。2)上述培養(yǎng)過程中加入ERK1/2MAPK抑制劑(PD98059)、p38MAPK抑制劑(SB203580)預(yù)處理后,磷酸化ERK1/2、p38MAPK和IL-10、IL-12p70水平的水平,以及DC數(shù)量的變化。3)CD4+T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):Mo經(jīng)PD98059(或SB203580

4、)和EAiC3b預(yù)處理后,與IL-4、GM-CSF共培養(yǎng)6天經(jīng)60Co照射后作為刺激細(xì)胞,同時(shí)分離同種異體人外周血CD4+T作為反應(yīng)細(xì)胞,共培養(yǎng)5天后,經(jīng)3H-摻入法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)。
　　結(jié)果:1)相比EA組結(jié)果,EAiC3b的加入使Mo向CD1a+DC方向的分化受到抑制,表現(xiàn)為CD1a+的表達(dá)明顯降低,磷酸化-ERK1/2MAPK的表達(dá)增加,磷酸化-p38MAPK的表達(dá)降低,IL-12p70的水平降低,IL-10的水

5、平增加,CD4+T細(xì)胞增殖減弱。2)前過程中加入PD98059預(yù)處理后,相比EAiC3b結(jié)果,則促進(jìn)了Mo向CD1a+DC方向的分化成熟,表現(xiàn)為CD1a+的表達(dá)明顯增加,磷酸化-ERK1/2MAPK的表達(dá)降低,IL-12p70的水平增高,IL-10的水平降低,CD4+T細(xì)胞增殖明顯提高。3)細(xì)胞經(jīng)SB203580預(yù)處理后,相比EAiC3b結(jié)果,Mo向CD1a+DC方向的分化成熟被進(jìn)一步抑制,表現(xiàn)為CD1a+的表達(dá)降低,磷酸化-p38MA

6、PK的表達(dá)降低,IL-12p70的水平稍有降低,IL-10的水平略有增高,CD4+T細(xì)胞增殖有所下調(diào)。
　　結(jié)論:1)紫外線引起的補(bǔ)體iC3b的沉積是引起CD1a+DC消失的重要原因;2)ERK1/2MAPK抑制劑PD98059可顯著逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象,促進(jìn)前體Mo向CD1a+DC的分化,而p38MAPK抑制劑SB203580則進(jìn)一步抑制CD1a+DC的分化成熟;3)經(jīng)iC3b作用的Mo對(duì)CD4+T細(xì)胞的增殖能力明顯減弱,PD預(yù)處理后可

7、顯著恢復(fù),SB預(yù)處理后加強(qiáng)這種抑制。
　　第二部分:ERK1/2MAPK抑制劑PD98059可明顯逆轉(zhuǎn)UVB誘導(dǎo)的小鼠皮膚局部免疫抑制,未觀察到SB203580對(duì)遲發(fā)性高敏反應(yīng)的抗炎作用
　　目的:在UVB誘導(dǎo)局部免疫抑制動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,觀察外涂PD9059能否逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象,以證實(shí)ERK1/2MAPK在免疫抑制中的關(guān)鍵作用,為開發(fā)防光劑提供新的思路;在接觸性高敏反應(yīng)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,觀察外涂SB203580觀察能否抑制炎癥反

8、應(yīng),為抗炎劑作基礎(chǔ)。
　　方法:建立UVB誘導(dǎo)局部免疫抑制的小鼠模型,即UVB8kJ/m2照射Balb/c小鼠腹部去毛皮膚后3天,在相同區(qū)域外涂25μ10.5％DNFB致敏,5天后測(cè)量基礎(chǔ)右耳廓厚度并在相同耳背處外涂10μ10.2％DNFB激發(fā),24小時(shí)后測(cè)量耳廓厚度并取右耳組織做HE病理。PD研究:UVB曝光前1小時(shí)(A組),曝光同時(shí)(A組),曝光后6小時(shí)(C組)外涂PD98059,余步驟同前,檢測(cè)耳腫反應(yīng)及HE染色。SB研究:

9、小鼠腹部去毛皮膚外涂不同濃度的SB203580,6小時(shí)后相同皮膚處外涂25μ10.5％DNFB致敏,5天后測(cè)量基礎(chǔ)右耳廓厚度并在耳背皮膚外涂10μ10.2％DNFB激發(fā),24小時(shí)后再次測(cè)量耳廓厚度并取耳組織做HE病理染色。各組均設(shè)對(duì)照。
　　結(jié)果:PD研究:UVB8kJ/m2及其以上劑量可引起局部免疫抑制,在此基礎(chǔ)上,光照后6小時(shí)外涂PD98059組(C組)可部分逆轉(zhuǎn)UVB誘導(dǎo)的局部免疫抑制,表現(xiàn)為和對(duì)照組相比,耳腫反應(yīng)有顯著性差

10、異(P＜0.05),而照光前1小時(shí)(A組)和照光同時(shí)(B組)外涂PD98059組耳腫反應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);HE染色示真皮水腫增厚伴淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。SB研究:和對(duì)照組相比,致敏前外涂不同濃度的SB203580對(duì)接觸性高敏反應(yīng)無明顯改變(包括耳腫反應(yīng)和病理HE染色)。
　　結(jié)論:ERK1/2MAPK通路在UVB誘導(dǎo)的皮膚免疫中起著關(guān)鍵作用,其抑制劑PD98059可顯著逆轉(zhuǎn)UVB誘導(dǎo)的免疫抑制,PD98059或類似物對(duì)UVB