GCK促進(jìn)紫外線照射細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是一組可被多種信號(hào)激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶。經(jīng)磷酸化活化的絲裂原活化蛋白激酶，可參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，如調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等。MAPK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，尤其是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)p38，ERK5，ERK以及JNK4個(gè)亞族。其中ERK，JNK，p38MAPK三條通路與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。<

2、br>　　 JNK信號(hào)通路是MAPK中重要的通路之一。最近的研究表明，JNK通路的激活與促凋亡作用有關(guān)?；罨腏NK通過(guò)磷酸化c-Jun和ATF2激活轉(zhuǎn)錄因子AP1，結(jié)果導(dǎo)致FasL表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。JNK介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的另一途徑是通過(guò)磷酸化Bcl-2和Bcl-xL，而后促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，從而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 GCK分子屬于Ser/Thr蛋白激酶，有研究表明GCK分子參與了JNK信號(hào)

3、通路，且表達(dá)外源性的GCK分子可以在細(xì)胞內(nèi)活化JNK。而通過(guò)RNAi技術(shù)沉默gck基因可以阻斷LPS和UV刺激活化JNK的信號(hào)通路。但是GCK分子具體如何調(diào)控JNK信號(hào)通路尚待探討。因此本文通過(guò)克隆GCK基因和構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，繼而初步觀察了紫外線照射對(duì)促進(jìn)UV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。論文共分為兩部分。
　　 1、人GCK基因克隆及其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建
　　 目的：克隆人GCK基因，并構(gòu)建含有該目的基因的plRES2-EGF

4、P-GCK重組質(zhì)粒載體，并獲得穩(wěn)定表達(dá)GCK分子的GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
　　 方法：以pCMV5-GCK質(zhì)粒為模板，PCR法獲得gck基因，將其裝入plRES2-EGFP質(zhì)粒載體中，脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用G418篩選出能穩(wěn)定表達(dá)GCK蛋白的GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pIRES2-EGFP-GCK質(zhì)粒載體，并建立了穩(wěn)定表達(dá)人GCK蛋白的GCK－HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株

5、。
　　 結(jié)論：構(gòu)建了含人GCK基因的重組plRES2-EGFP-GCK質(zhì)粒載體和穩(wěn)定表達(dá)人GCK蛋白的GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，為該基因功能的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2、GCK分子對(duì)促進(jìn)UV誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的研究
　　 目的：研究GCK分子促進(jìn)UV誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：分別選取GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、plRES2-HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、HEK2

6、93細(xì)胞2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12h后，進(jìn)行不同時(shí)間的UV照射。2min、4min、5min、6min。繼續(xù)培養(yǎng)24h。離心收集細(xì)胞，PI染色lmin，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的死亡率。UV照射HEK293，5min，24h后，裂解細(xì)胞，收集上清檢測(cè)GCK分子的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1．經(jīng)過(guò)不同時(shí)間UV的照射，在24h后，GCK-HEK293轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與pIRES2-HEK29轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和HEK293相比，細(xì)胞的死亡率