脂肪源性干細胞對皮膚慢性紫外線照射損傷的治療研究.pdf

1、目的:
　　本研究擬通過紫外線對大鼠背部局部照射建立慢性皮膚損傷模型，探討ADSCs(adipose-derived stem cells，ADSCs)移植對慢性紫外線照射皮膚損傷的治療作用，為臨床移植ADSCs治療皮膚光老化提供實驗依據(jù)。
　　1、通過人ADSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定，了解ADSCs生長、分化情況;
　　2、改良皮膚慢性照射損傷模型的建立方法;
　　3、探討ADSCs應用于臨床治療皮膚光老化損傷的

2、可行性，為治療光老化探索新思路。
　　方法:
　　第一部分:以酶消化法從人脂肪組織中提取ADSCs，然后接種于培養(yǎng)皿，使用HG-DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)至第三代。利用倒置顯微鏡觀察原代細胞形態(tài);用流式細胞儀對細胞表型進行鑒定;加入不同誘導劑，驗證干細胞成骨、成脂分化的能力。
　　第二部分:SD大鼠背部皮膚慢性照射損傷模型的建立:將大鼠背部毛發(fā)脫去，每日固定時間進行UV照射，最終致其背部皮膚出現(xiàn)光老化;手術切取大鼠照射部位

3、的皮膚組織，并進行H&E、VVG染色，通過倒置顯微鏡觀察，以確定造模是否成功。
　　第三部分:取第三代處于對數(shù)生長期的ADSCs，消化后用PBS重懸調(diào)整濃度至1.5×105個/ml。每只大鼠背部標記a,b，c3塊區(qū)域，以每個區(qū)域1ml的劑量，將ADSCs懸液均勻注射至治療組6只大鼠背部b區(qū)及c區(qū)皮下組織內(nèi)。以相同劑量PBS均勻注射至空白及模型組12只大鼠背部b區(qū)及c區(qū)皮下組織內(nèi)。治療每周注射一次，為期四周。治療結束后，每次手術間隔

4、一周，依次切取a、b、c三區(qū)域皮膚組織，固定于福爾馬林溶液中。通過對皮膚組織切片進行H&E、VVG染色、SOD酶活性測定、MDA含量測定，探討ADSCs對于慢性UV照射皮膚損傷的治療作用。
　　結果:
　　第一部分:ADSCs體外培養(yǎng)一周后，大多數(shù)細胞呈梭形、不規(guī)則三角形或多邊形，生長呈束狀或漩渦狀。傳代后，增殖速度較快，一周左右達到90％融合度，而且其免疫表型與臍帶間充質干細胞的表達具有高度一致性。繼續(xù)培養(yǎng)，ADSCs展現(xiàn)

5、出了良好的成脂、成骨的多向分化能力。成脂誘導在10日左右可達到90％以上分化;成骨誘導在20日左右可達90％以上分化。
　　第二部分:采用大體肉眼觀察、組織切片H&E染色鏡下觀察及VVG染色觀察，發(fā)現(xiàn)UV照射后，皮膚表皮增厚、膠原變性斷裂，炎性細胞浸潤，出現(xiàn)明顯的皮膚組織照射損傷，確定模型建立成功;從實驗中，總結出最佳UV損傷模型建立方法:每天持續(xù)照射1.5h，從第三周開始每兩周增加10min，共照射8周，總照射時長100h，UV

6、B總劑量為7～8J/cm2。
　　第三部分:ADSCs移植后，大鼠背部皮膚慢性紫外線照射損傷后的真皮層膠原合成增加、真皮厚度增加、表皮厚度減少、炎性細胞浸潤得到改善、SOD酶活性增加、MDA過氧化物沉積減少，證明ADSCs的存留對照射后皮膚慢性損傷具有明顯治療作用。
　　結論:
　　第一部分:通過經(jīng)典的酶消化法成功提取ADSCs，并依照國際標準對其進行鑒定;通過描繪ADSCs生長曲線，對ADSCs生長特點及其形態(tài)特征有