脂肪源性干細胞移植治療缺血性腦損傷的實驗研究.pdf

1、背景:神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)，更新了以往認為神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀點，使人們對神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能有了一個全新的認識，并且也為臨床對腦和脊髓外傷、以及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾患提供了一個新的有效治療途徑，但因其不易獲得且存在倫理學問題，實用性受到很大限制。脂肪來源的多能干細胞(簡稱ADSCs)具有來源豐富、采集方便、體外擴增快和自體移植等特點，預(yù)示了此種來源的干細胞在I臨床細胞移植治療上將具有很大的優(yōu)勢。有研究報道，脂肪干細胞可在體外誘導分化為神經(jīng)元樣

2、細胞，移植入缺血腦組織后可通過分化為神經(jīng)元等細胞和分泌神經(jīng)保護性生物因子等途徑而達到修復(fù)作用。 目的:研究ADSCs在一定的培養(yǎng)條件下可被誘導成神經(jīng)干細胞并進一步分化成神經(jīng)元樣細胞，并表達神經(jīng)干細胞特異性標記物Nestin和神經(jīng)元特異性標記物NSE。探索使用超順磁性納米氧化鐵顆粒(SPIO)和多聚左旋賴氨酸(PLL)復(fù)合物對脂肪干細胞進行磁性標記和MRI用于示蹤磁性標記ADSCs的可行性，探索腦缺血損傷后脂肪干細胞移植治療腦組織

3、損傷的作用機制。 方法:Sprague-Dawley大鼠(鼠齡2～4個月)過量麻醉處死，無菌條件下取出腹股溝脂肪組織，使用膠原酶I消化，分離、培養(yǎng)得到ADSCs，取培養(yǎng)的第三代ADSCs使用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基誘導分化，檢測誘導后的ADSCs表達神經(jīng)干細胞標志物和ADSCs分化后表達神經(jīng)元特異性標志物的情況；同樣取第三代ADSCs在體外使用SPIO-PLL復(fù)合物行磁性標記，臺盼蘭拒染試驗判斷磁性標記對ADSCs的活性有無影響，普魯士

4、藍染色和體外MRI判斷ADSCs磁性標記的有效性；36只缺血造模成功的Sprague-Dawley大鼠分成缺血對照組、PBS治療組和磁性標記ADSCs治療組，每組12只。造模后3天，采用立體定向儀進行細胞移植，移植位點：皮質(zhì)(前囟后3mm，旁開3mm，深4mm)，垂直距離以顱骨外板為標準。SPIO標記組大鼠在ADSCs腦內(nèi)移植后當天和第3周進行磁共振動態(tài)觀察。采用改良神經(jīng)損害嚴重程度評分(改良NSS評分)對ADSCs移植后各組動物進行神

5、經(jīng)系統(tǒng)行為和運動功能評估。移植后21天處死所有大鼠取下腦組織固定行神經(jīng)元特異性稀醇化酶(NSE)、CD31免疫組化染色和普魯士藍染色。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，以P＜0.05表示差異具有顯著性。 結(jié)果: 1)由脂肪組織來源的多能干細胞可在體外培養(yǎng)并穩(wěn)定增殖，ADSCs經(jīng)免疫熒光染色，絕大多數(shù)細胞呈CD44陽性。 2)第3代的ADSCs在誘導培養(yǎng)基作用下可被誘導為神經(jīng)干

6、細胞樣生長的細胞團，神經(jīng)干細胞標記物nestin免疫組化染色陽性，經(jīng)誘導分化后表達神經(jīng)元標記物NSE。 3)傳代至第3代的ADSCs體外行SPIO+PLL復(fù)合物標記后進行Prussian Blue染色，幾乎所有的磁性標記ADSCs胞質(zhì)內(nèi)均可見多少不等的藍染鐵顆粒，標記率為100％，而未經(jīng)PLL修飾的SPIO標記ADSCs，僅少數(shù)細胞胞質(zhì)內(nèi)見藍染的鐵顆粒；各時相點磁標記細胞的Typan Blue拒染率與未標記細胞間無統(tǒng)計學意義。體

7、外MR成像時，SPIO-PLL標記的ADSCs于T2WI上可使MR信號明顯減低。 4)將SPIO-PLL標記和未標記的ADSCs移植到正常的SD大鼠雙側(cè)大腦實質(zhì)中，1周后使用1.5TMR掃描儀檢查，見磁性標記ADSCs移植處在T2WI和T2*WI序列均呈低信號改變，其中以T2*WI序列最為敏感，而未標記ADSCs移植處未見低信號改變。 5)在ADSCs腦內(nèi)移植后進行磁共振動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，損傷對側(cè)腦內(nèi)移植的磁性標記ADSCs

8、可通過胼胝體遷移至缺血性腦損傷灶周圍。腦組織NSE、CD31免疫組化染色顯示部分ADSCs陽性，與MR示蹤成像上所顯示的低信號區(qū)相對應(yīng)部腦組織普魯士藍染色可見染色陽性的移植細胞。 6)NSS評分顯示ADSCs移植組大鼠神經(jīng)系統(tǒng)行為和運動功能改善較對照組大鼠明顯。 結(jié)論:ADSCs可在體外一定的誘導條件下誘導成nestin表達陽性的神經(jīng)干細胞樣生長的細胞團，且可進一步分化成神經(jīng)元樣細胞。SPIO-PLL復(fù)合物可安全有效地標