脂肪干細胞移植治療腦冷凍損傷的實驗研究.pdf

1、在現代社會里，由于工業(yè)與交通的快速發(fā)展，急性中樞神經系統(tǒng)損傷的發(fā)生率幾乎呈直線上升；然而一方面雖然現代科學技術日益發(fā)展，高精尖設備業(yè)已應用于臨床醫(yī)學的診斷與治療，但另一方面不可否認的是中樞神經系統(tǒng)損傷的致殘率與死亡率卻始終居高不下。面對這一棘手而現實的矛盾，世界各國均投入大量的人力、財力來研究中樞神經系統(tǒng)損傷后的修復這一神經科學的重大難題，其間干細胞(Stern cells)的發(fā)現和研究給這類疾病帶來了希望的曙光，但目前關于干細胞的研究

2、還主要停留在實驗室階段，而干細胞在神經系統(tǒng)疾病臨床應用領域的研究則甚少，僅有關于神經退行性變的研究暫時處于領先地位，例如胚胎干細胞治療帕金森病的研究工作也已經進入臨床階段。 我們知道，中樞神經損傷后，由于神經細胞死亡、神經突觸連接斷裂以及神經細胞凋亡的發(fā)生，加上內源性的修復系統(tǒng)傾向于形成膠質細胞瘢痕修復，因此難以形成有效的神經功能修復從而影響疾病的預后。雖然干細胞治療神經損傷已經成為一種趨勢，但是由于多種原因目前這方面的工作進展

3、還是比較緩慢，比如取材困難和倫理問題都限制著對干細胞的研究。然而近年來，脂肪干細胞(Adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)已逐漸成為干細胞研究的一個新的趨向，因為這種干細胞來源于成脂細胞，具有取材容易，并可以向脂肪、骨、軟骨、平滑肌、心肌、內皮、肝臟以及神經等多種組織分化的優(yōu)點，因此為干細胞的研究和應用打開了一扇大門，本實驗就是建立在觀察移植脂肪干細胞治療腦冷凍損傷前后相關指標變化的基礎上，希望

4、能為脂肪干細胞在神經系統(tǒng)損傷治療領域中的應用奠定基礎。 本實驗的內容包括：體外提取培養(yǎng)和純化ADSCs，檢測ADSCs的相關分子標記物，觀察ADSCs的分化能力，并誘導其向神經元的方向分化。另外還要制作實驗大鼠的腦冷凍傷模型，最后觀察移植ADSCs后其對冷凍傷腦組織的保護情況以及對細胞凋亡的抑制情況和對損傷后神經功能障礙帶來的改善并且研究這些過程形成的原因。本次實驗分為兩部分： 一 ADSCs的培養(yǎng)以及向神經元方向的定向

5、分化 目的：從大鼠脂肪組織中分離出脂肪干細胞(ADSCs)，體外培養(yǎng)觀察其形態(tài)、生長方式以及表面標志物表達等生物學特征。誘導ADSCs向神經細胞方向分化，觀察其形態(tài)學特征和特異標志物的表達。 方法：無菌條件下取SD大鼠的腹股溝和腹膜后脂肪，用機械分離和膠原酶消化結合的方法分離出ADSCs，并接種于15％FBSDMEM low Glucose培基中。進行純化和傳代，相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞的形態(tài)。取第五代細胞進行流式細胞技

6、術檢測抗原標志物CD29、CD34、CD44。通過兩步誘導法誘導ADSCs向神經細胞方向分化，免疫熒光法檢測NSE、GFAP抗原的表達情況。低溫凍存脂肪干細胞，并復蘇傳代。 結果：從大鼠的脂肪組織中可分離培養(yǎng)ADSCs，呈貼壁式生長，貼壁速度快，為梭形細胞形態(tài)，在含血清培養(yǎng)中能夠連續(xù)傳代并穩(wěn)定增殖。流式細胞技術檢測顯示這種脂肪來源的細胞CD34表達為陰性，CD29和CD44表達率在90％以上。經含bFGF和β-巰基乙醇的培養(yǎng)基聯

7、合誘導后，ADSCs可分化為強烈表達NSE的神經元樣細胞，而未見星形膠質細胞特異表面標志GFAP的表達。凍存和復蘇后的ADSCs仍然能穩(wěn)定傳代并被誘導向神經元方向分化。 結論：1.大鼠的脂肪組織類可以分離出具有強大的體外擴增能力的細胞，這類細胞表達CD44、CD29等間充質干細胞的表面標志。2.脂肪來源的干細胞可以穩(wěn)定的傳代，經過神經方向誘導技術的誘導，這類細胞可以分化為表達NSE抗原的神經元樣細胞。3.脂肪干細胞可以被凍存和復

8、蘇，復蘇后細胞仍然可以穩(wěn)定傳代。 二脂肪干細胞移植治療腦冷凍傷動物模型 目的：觀察脂肪干細胞移植進入腦凍傷大鼠腦內后對動物的影響，研究脂肪干細胞移植做為一種新的手段治療神經系統(tǒng)疾病的可行性。 方法：體外培養(yǎng)并傳代純化的SD大鼠脂肪干細胞(ADSCs)，用BrdU標記過夜備用。用液氮硬膜外冷凍法制作大鼠的腦冷凍傷模型，將大鼠分為實驗組(腦冷凍傷后12，14小時腦內移植Brdu標記的ADSCs)動物數量25只，對照組

9、(腦冷凍傷后12，24小時移植DMEM培基)動物數量25和假手術組(僅行顱骨開窗手術)動物數量5只。分別在移植細胞后1，3，7，14,30天各個時間點對實驗動物進行NSS神經功能評分，處死實驗大鼠，制作腦組織切片，行免疫熒光染色檢測BrdU陽性細胞。行Tunel染色檢測凋亡細胞，腦組織RT-PCR檢測VEGF、BDNF等因子mRNA表達，Western blot檢測VEGF、BDNF蛋白的表達。統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析，統(tǒng)計學軟件采

10、用SPSS11.0軟件包完成。 結果：在移植了ADSCs后，免疫熒光學方法可以檢測到Brdu標記的ADSCs在實驗組大鼠腦組織內分布并且向病灶中心位置遷移，并且可以檢測到Brdu和Nse雙標陽性的細胞。實驗組大鼠在3,7天兩時間點同對照組相比NSS評分有顯著差異(P<0.05)。RT-PCR檢測結果顯示實驗組大鼠腦組織中BDNF表達在1-14天表達比對照組更高(P<0.05)而VEGF表達實驗組在所有時間點都高于對照組(P<0.

11、05)，Western blot檢測實驗組的BDNF蛋白水平在1-14天與對照組相比明顯的升高(P<0.05)而VEGF蛋白在所有時間點都表達升高，并且通過Tunel凋亡檢測發(fā)現移植ADSCs后所有時間點實驗組大鼠腦組織中凋亡細胞比對照組明顯減少(P<0.05)。 結論：1.成功制作大鼠腦冷凍傷動物模型，模擬了腦水腫和繼發(fā)性腦損傷。2.脂肪干細胞可以在中樞神經系統(tǒng)中存活，遷移并分化為神經元樣細胞 3.它可以引起VEGF、BDNF