何首烏FmSTS2基因的克隆、鑒定和其與二苯乙烯苷合成關(guān)系分析.pdf

1、藥用植物何首烏(Fallopia multiflora Thunb.)是著名的傳統(tǒng)大宗中草藥材，其具有補肝腎、益精血、烏須黑發(fā)、養(yǎng)心安神等功效。何首烏的主要化學成分包括二苯乙烯類(stilbenes)、蒽醌類(anthraquinones)、磷脂類(lecithin)。其中最重要的就是其主要藥效成分二苯乙烯苷，即2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙（2，3，5，4'-tetrahydroxystibene-2-O-

2、β-D-glucoside，TSG）?，F(xiàn)代藥理學已經(jīng)證實二苯乙烯苷具有抗菌、消炎、抗腫瘤、酪氨酸酶抑制等多種生物活性，并在降血脂、抗衰老、保護心血管及抗動脈粥樣硬化等方面有很好的應用前景。目前國內(nèi)外對何首烏中二苯乙烯苷的生物活性，藥理作用等研究較為透徹，而對其在何首烏中的代謝合成途徑和關(guān)鍵酶、基因的研究卻未見報道。同時由于二苯乙烯苷在何首烏藥材中的含量較為微少，其含量變化具有組織特異性，時序性，和空間限制性，限制了其廣泛應用。對二苯乙烯

3、苷在何首烏中合成關(guān)鍵酶、基因的研究將為后續(xù)利用次生代謝工程調(diào)節(jié)二苯乙烯苷產(chǎn)量、滿足人類日益增長的藥用保健需求及植物防御、作物品質(zhì)改良提供幫助。同時也是對植物二苯乙烯類次生代謝物質(zhì)合成，調(diào)控機制的豐富和發(fā)展。因此對何首烏中二苯乙烯苷合成途徑中相關(guān)酶、基因的研究具有十分重要的意義。
　　 已有研究表明白藜蘆醇等二苯乙烯類物質(zhì)來源于苯丙氨酸途徑。苯丙氨酸代謝途徑，起始分子為苯丙氨酸，在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的催化下產(chǎn)物為肉桂酸(Ci

4、nnamic acid);接下來肉桂酸4-羥基化酶(C4H)在肉桂酸的對位點上催化位置特異性的羥化反應，將反式肉桂酸催化生成對-香豆酸，是為苯丙氨酸途徑的第二步反應。而4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)作用于苯丙酸途徑中最后一步反應，催化各種羥基肉桂酸生成相應的硫酯包括肉桂酰輔酶A和香豆酰輔酶A。白藜蘆醇等二苯乙烯類物質(zhì)的二苯乙烯母核是以苯丙氨酸途徑產(chǎn)生的香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A和為底物，由二苯乙烯合成酶(stilbenesynthas

5、e，STS)催化合成，再經(jīng)修飾、聚合等作用形成結(jié)構(gòu)不同的二苯乙烯類物質(zhì)。可見二苯乙烯合成酶是許多二苯乙烯類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。而何首烏中是否存在二苯乙烯合成酶，以及該酶是否與二苯乙烯苷的合成相關(guān)還不清楚。為了深入研究何首烏中二苯乙烯苷的生物合成途徑中相關(guān)酶、基因，為今后利用基因工程技術(shù)提高二苯乙烯苷類的含量滿足藥用保健需求奠定基礎(chǔ)，同時也為進一步了解植物二苯乙烯類物質(zhì)合成調(diào)控機制，本課題針對何首烏中的二苯乙烯合成酶基因進行研究。
　

6、　 目的和意義:克隆何首烏中的二苯乙烯合成酶基因并進行酶催化反應鑒定，研究二苯乙烯合成酶基因在何首烏各組織的表達與二苯乙烯苷表達的關(guān)系，為研究二苯乙烯合成酶基因在二苯乙烯苷合成及其調(diào)控中的功能、二苯乙烯苷生物合成途徑以及今后利用基因工程技術(shù)提高二苯乙烯苷類的含量滿足藥用保健需求奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法和內(nèi)容:
　　 1.何首烏總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
　　 取何首烏的新鮮塊根用百泰克RNA提取試劑盒抽提RNA，

7、以O(shè)ligo dT18為引物按Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA第1條鏈的合成。
　　 2.何首烏二苯乙烯合成酶基因cDNA全長序列的獲得
　　 依據(jù)STS基因家族的蛋白保守區(qū)域，主要是何首烏近緣物種大黃和虎杖等的STS基因序列設(shè)計引物，以獲得的cDNA為模板，PCR擴增何首烏STS的保守區(qū)片段。根據(jù)STS保守區(qū)測序結(jié)果設(shè)計RACE特異性引物。利用提取的RNA，采用Invitrogen公司的5'RACE Syste

8、m for Rapid Amplification of cDNAEnds，Version2.0試劑盒獲得該基因的5'端序列。采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3'端序列。兩端RACE的第二輪擴增產(chǎn)物進行膠回收純化、連接至PMD-18T，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆測序。拼接后獲得何首烏STS基因cDNA的全長序列。命名為FmSTS2，獲取GeneBank登錄號。

9、
　　 3.FmSTS2的原核表達
　　 以何首烏cDNA為模板，擴增FmSTS2的開放閱讀框。將純化回收的PCR產(chǎn)物與和表達載體pET28a用T4DNA連接酶連接，使FmSTS2 N端融合pET28a(+)載體上的6×His標簽，可以高度親和Ni2+。轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細菌，涂布含50mg/L卡那霉素(Kan)的固體LB平板。長出的菌落進行菌落PCR鑒定和測序驗證。挑取陽性單克隆，用含Kan的LB液體培養(yǎng)基37℃，20

10、0 rpm振蕩培養(yǎng)，OD600=0.6時，加入1 mM IPTG誘導蛋白表達。首先將誘導溫度設(shè)為30℃[6]，將菌液分別誘導4h、5h、6h、7h、8h、9h后，離心收集菌體，用2ml磷酸鉀緩沖液(PH=7.5)懸浮，冰上超聲10min，離心后取上清進行可溶性蛋白的SDS-PAGE分析，得到最佳誘導時間。在最佳誘導時間的條提下，SDS-PAGE檢測誘導溫度分別為20、23、25、28、30、35℃時可溶性蛋白的表達情況。
　　

11、4.融合蛋白的分離純化
　　 按照得到的最佳誘導溫度和時間誘導菌液表達可溶性蛋白，將超聲過的菌液4℃條件下10，000 g離心10min。上清液過Ni-NTA親和樹脂層析柱純化融合蛋白。用含有0.5m NaCl和40 mM咪唑的0.1M的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)平衡柱子后用含有400 mM咪唑的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)洗脫洗脫重組蛋白。收集洗脫下來的組分并進行SDS-PAGE檢測。將純化的蛋白溶液透析過夜后置于-80

12、℃，冷凍成冰后置于凍干機中真空冷凍干燥成粉末。
　　 5.酶活性鑒定
　　 反應體系包括150μM的香豆酰輔酶A，280μM的丙二酰輔酶A，10μg純化后的重組蛋白和0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)共250μL。35℃條件下孵育30分鐘。反應產(chǎn)物用250μL的醋酸乙酯萃取兩次，真空干燥后，用50μl的80％(v/v)乙醇溶解作為待測液。采用HPLC進行酶催化產(chǎn)物的分析。色譜條件:迪馬C18(4.6mm×250mm，5μ

13、m);流動相為乙腈-水(25∶75);流速1ml/mim檢測波長306 nm;柱溫25℃;進樣量10μl。
　　 6.HPLC檢測何首烏各個組織二苯乙烯苷含量
　　 取同一株何首烏的塊根，老藤，莖，葉片液氮研磨成粉末置于55℃烘干25h。過80目篩，取粉末0.2g溶于25ml50％乙醇冷浸過夜，0.45μM濾膜過濾待測。0.004g標準品二苯乙烯苷溶于10ml(50％乙醇)作為對照品，過濾待測。色譜條件:迪馬C18(4.

14、6mm×250mm，5μm);流動相乙腈-水(25∶75);流速1ml/min;檢測波長320nm，柱溫25℃;進樣量10μl。
　　 7.RT-PCR檢測FmSTS2在何首烏各個組織的表達
　　 按1法分別對6中同一株何首烏的塊根，老藤，莖，葉進行RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。將各組織的cDNA總量調(diào)成50ng/μl，分別進行PCR擴增FmSTS2。Actin(Ⅰ)作為內(nèi)參。
　　 主要結(jié)果:
　　 1.何首烏

15、STS保守區(qū)的擴增和全長的獲得
　　 擴增何首烏二苯乙烯合成酶基因保守區(qū)，測序得到780bp左右大小的片段。根據(jù)該序列設(shè)計引物，5'RACE電泳結(jié)果顯示在850bp左右得到目的條帶;3'RACE電泳結(jié)果顯示在250左右擴增得到目的條帶，將PCR產(chǎn)物回收克隆T載體后進行測序，通過序列拼接獲得含有一個完整編碼區(qū)的基因序列，命名為FmSTS2(GenBank登錄號為:JX914503)，全長cDNA序列為1644bp，包括441bp的

16、5'非翻譯區(qū)(UTR)，66bp的3'UTR1137bp的ORF,編碼378個氨基酸。預測蛋白分子量大小為42kDa。
　　 2.FmSTS2基因的原核表達和鑒定
　　 SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導的空白對照菌無目的蛋白條帶產(chǎn)生，可溶性的重組蛋白在42 kDa處出現(xiàn)條帶，并且隨誘導時間的增加而增加，但到7h時表達量達到最大。而可溶性蛋白在28℃之前表達量依次增多，到28℃達到最大值。HPLC色譜圖顯示，酶

17、催化產(chǎn)物供試液與白藜蘆醇對照品具有相同的保留時間峰(13.24min)。說明催化產(chǎn)物主要為白藜蘆醇，說明原核表達蛋白具有二苯乙烯合成酶的活性。說明克隆的酶基因為二苯乙烯合成酶基因。
　　 3.何首烏中FmSTS2的表達和二苯乙烯苷含量的關(guān)系分析
　　 HPLC結(jié)果經(jīng)分析之后得到二苯乙烯苷在何首烏中各個組織的含量。結(jié)果顯示塊根中二苯乙烯苷含量最高(3.37％)，老藤其次(0.78％)，而莖(0.06％)和葉(0.007％)

18、中的含量很低。RT-PCR檢測FmSTS2基因在何首烏不同組織中的表達，電泳結(jié)果表明，作為內(nèi)參的細胞核基因Actin(Ⅰ)在何首烏各個組織表達一致，而FmSTS2在塊根中的表達量最高，其次是老藤，在幼莖和葉片中表達微量。
　　 主要結(jié)論:從傳統(tǒng)中藥材何首烏的塊根中克隆到一種二苯乙烯合酶FmSTS2，其互補cDNA全長1644bp，成功構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，表達的重組蛋白具有催化合成二苯乙烯類物質(zhì)白藜蘆醇的活性。該基因在何首烏不同組織