何首烏有效成分二苯乙烯苷的降血脂作用與藥物代謝動力學(xué)研究.pdf

1、何首烏為蓼屬植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根，具有多種藥理作用。 本文通過比較TSG單體成分與含相同量TSG的何首烏總提物(有效部位)的降血脂作用，確定TSG為何首烏降血脂的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并較深入地研究了TSG在動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等一系列過程，為TSG的開發(fā)利用奠定了堅實的基礎(chǔ)。 七寶美髯丹是以何首烏為君藥的復(fù)方制劑，含有多種有效成分，為了更好的控制藥品質(zhì)量，

2、本文建立了RP-HPLC法同時測定二苯乙烯苷等七種組分的含量。 第一部分何首烏降血脂作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究 目的：比較研究何首烏有效部位(HSWAF)及有效成分TSG的降血脂作用，明確何首烏降血脂作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法：觀察HSWAF和TSG對正常小鼠血脂及肝指數(shù)的影響；小鼠腹腔注射Triton致急性高脂血癥模型，觀察HSWAF和TSG對模型動物血脂、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)水平的影響；以大

3、鼠食餌性高脂血癥為模型，給予高脂飼料的同時給予HSWAF和TSG，連續(xù)28天，測定血脂、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，肝組織中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量以及肝指數(shù)。 結(jié)果：對正常小鼠，TSG和HSWAF均有升高血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，降低血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的作用。HSWAF和TSG對腹腔注射Triton致高脂血癥小鼠的血清TC和TG均有降低作用，

4、對HDL-C均有升高作用。HSWAF 60 mg/kg明顯降低大鼠食餌性高脂血癥模型的肝指數(shù)；HSWAF 30 mg/kg和60 mg/kg明顯降低大鼠食餌性高脂血癥模型的血清TC、TG、LDL-C、MDA含量、TC/HDL-C比值，明顯升高血清HDL-C和NO含量以及SOD活性，TSG對以上各項指標的作用強度略低于HSWAF，但無顯著性差異。 結(jié)論:何首烏中有效部位及有效成分TSG均具有調(diào)血脂、抗氧化，保護血管內(nèi)皮的功能，TS

5、G為發(fā)揮藥效作用的主要物質(zhì)，提示可用于防治高脂血癥。 第二部分二苯乙烯苷在高血脂模型大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究與組織分布 目的:研究TSG在不同高血脂病理模型動物體內(nèi)的藥動學(xué)及組織分布情況。 方法:1. 分別取正常大鼠，食靡性高脂血癥模型大鼠和Triton致高脂血癥模型大鼠，按60 mg/kg的劑量灌胃給予TSG，于給藥后不同時間經(jīng)眼球后靜脈叢取血，置肝素化試管中，以3000 r/min離心10 min，分離血漿。以虎

6、杖苷為內(nèi)標，用3倍量甲醇沉淀蛋白，取一定量上清液，于50℃氮氣流吹干，用少量甲醇溶解后，取上清液20μl注入液相色譜儀。C18色譜柱(250 mm×4.6 min，5μm)，流動相為乙腈-甲醇-0.1％冰醋酸(12:10:78)，檢測波長320 nm，流速為1.0 ml/min。記錄TSG與虎杖苷的峰面積，計算TSG的血藥濃度。 2. 分別取正常大鼠，食靡性高脂血癥模型大鼠和Triton致高脂血癥模型大鼠，按60 mg/kg的劑

7、量灌胃給予TSG，分別于給藥后5、15、45 min斷頭處死，分別取出心，肝，脾，肺，腎，腦，胃，小腸等組織，用生理鹽水制成1:2的組織勻漿。組織勻漿加3倍量甲醇沉淀蛋白，離心，取20μl上清液注入液相色譜儀。C18色譜柱(250mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈-甲醇-0.1％冰醋酸(15:18:67)；檢測波長320 nm，流速為1.0 ml/min。測定組織中TSG的含量。 結(jié)果: 1. 血漿中TSG在0.

8、13-81.00μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，高、中、低3種不同濃度血漿樣品的方法回收率分別為99.7％、98.9％、98.3％，日內(nèi)與日間精密度RSD均＜3.0％。與正常大鼠相比，TSG在triton致高脂血癥模型大鼠體內(nèi)的Tmax有降低趨勢，t1/2非常顯著性縮短(p＜0.01)，Cmax、Ke、AUC0-t與AUC0-∞均非常顯著性增加(p＜0.01)；脂肪乳致高脂血癥模型大鼠與正常大鼠相比，AUC0-t與AUC0-∞顯著性增

9、加(p<0.05)外，其它參數(shù)均無顯著性差異(p>0.05)。Triton致高脂血癥模型大鼠與食靡性高脂血癥模型大鼠相對正常大鼠的相對生物利用度分別為188％和155％。 2. 各組織中TSG濃度在0.65～162.00 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，高、中、低3種不同濃度肝臟勻漿樣品的方法平均回收率分別為100.5％、102.3％、100.9％，日內(nèi)與日間精密度RSD均<3.0％。與正常大鼠相比，在triton高脂血癥模型大鼠

10、體內(nèi)，TSG除在腎臟中的分布有所減少外，其它均無明顯變化；在食靡性高脂血癥模型大鼠的心臟中明顯減少，而在肝臟、脾臟和腎臟中均明顯增加。 結(jié)論：TSG在高脂血癥模型動物體內(nèi)的藥動學(xué)及組織分布發(fā)生了某些變化，提示在進行藥物的體內(nèi)過程研究時應(yīng)充分考慮機體的生理狀態(tài)，在可能的情況下盡量選擇相關(guān)的病理模型進行研究，使實驗結(jié)果更接近真實情況。 第三部分二苯乙烯苷的血漿蛋白結(jié)合率測定 目的：研究TSG的血漿蛋白結(jié)合情況，并探討

11、用濁點萃取法(CPE)測定TSG血漿蛋白結(jié)合率的方法。 方法：分別采用平衡透析法、超濾法和CPE法測定濃度為0.05、0.25、1.25 mg/ml的TSG與人血漿，牛血清白蛋白(BSA)和α1-酸性脂蛋白(α1-AGP)的結(jié)合情況，并將3種方法的測定結(jié)果進行比較。濁點萃取方法為：200μl樣品，精密加入1.0 ml濃度為5％(w/v)的。Triton X-114溶液，渦旋混合，置35℃恒溫振蕩器中保溫10 min，進行相分離，

12、于3000r/min離心5 min，上層為水層(游離型藥物)，體積為850μl，下層為表面活性劑層(結(jié)合型藥物)，體積為350μl，用標準曲線法測定結(jié)合型藥物的含量。 結(jié)果：在不同濃度(0.05、0.25、1.25 mg/ml)下，用平衡透析法、超濾法和CPE法測得的TSG與血漿蛋白的結(jié)合率(％)非常相似，分別為：55.8±4.1、53.4±4.4、51.9±5.0，79.6±3.3、74.2±3.3、72.5±2.6，89.8

13、±1.8、85.0±3.6、87.4±1.3。用平衡透析法和超濾法測得的結(jié)果均表明，TSG與血清白蛋白的結(jié)合率基本不隨濃度發(fā)生變化(約60％)，與α1-AGP的結(jié)合率則隨藥物濃度的增加而明顯降低，而用CPE法測定的兩種蛋白的結(jié)合率均在80％～90％，與上述兩種方法的差別很大。 結(jié)論：CPE法可用于測定TSG的血漿蛋白結(jié)合率。TSG既能與血清白蛋白結(jié)合又能與α1-AGP結(jié)合，血漿中還可能存在其他能和TSG結(jié)合的蛋白質(zhì)。 第

14、四部分二苯乙烯苷在大鼠體內(nèi)的吸收動力學(xué)研究 目的：建立同時測定胃灌注液及腸循環(huán)液中TSG及酚紅濃度的HPLC/PDA法，并研究TSG在大鼠胃、腸的吸收特性。 方法：采用大鼠在體胃、腸吸收模型，以HPLC/PDA法測定胃灌注液及腸循環(huán)液中藥物的含量，色譜條件為：Dikma Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30℃；流動相為乙腈-甲醇-0.2％磷酸(35:15:50)，流速1 ml

15、/min；檢測波長320 nm(TSG)和430 nm(酚紅)；進樣量20μl。 結(jié)果：TSG及酚紅的線性關(guān)系良好，線性范圍分別為3.5～140μg/ml和1～40μg/ml，日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于3.1％，方法回收率均在99.48％～102.5％之間。不同質(zhì)量濃度(2.5、5、10 mg/ml)的TSG在大鼠胃部的每小時吸收百分率分別為72.7、67.7、56.6；不同質(zhì)量濃度(30、60、120μg/ml)的TSG

16、在腸道內(nèi)的吸收速率常數(shù)分別為0.047 7、0.051 4、0.0563，三者之間無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：本文首次建立了HPLC/PDA法同時測定胃灌注液及腸循環(huán)液中TSG及酚紅的濃度，該法操作簡便，結(jié)果準確，靈敏度高。研究結(jié)果表明，TSG在腸道內(nèi)吸收較差，主要吸收部位是胃，為延長藥物在胃內(nèi)的停留時間，改善生物利用度，適合制成胃漂浮片。 第五部分二苯乙烯苷在大鼠體內(nèi)外的代謝研究 結(jié)論：TSG在肝臟代

17、謝為葡糖醛酸結(jié)合物，并經(jīng)膽汁排泄，在腸道內(nèi)菌或酶的作用下水解為原型隨糞便排出體外。 第六部分二苯乙烯苷在大鼠體內(nèi)的排泄研究 結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)考察符合生物樣品的測定要求，可應(yīng)用于大鼠膽汁中TSG及其代謝物濃度的測定，TSG在大鼠體內(nèi)主要以代謝物的形式由膽汁排泄。 第七部分二苯乙烯苷體內(nèi)過程研究模式的建立及其應(yīng)用 結(jié)論：TSG在胃部以游離形式被胃粘膜吸收，經(jīng)肝門靜脈進入肝臟，在肝臟內(nèi)發(fā)生代謝作用，主要是與體內(nèi)的