熱休克蛋白70在高壓氧預(yù)防減壓病中的作用機(jī)制.pdf

1、當(dāng)機(jī)體所處的環(huán)境氣壓發(fā)生快速大幅度變化時(shí)(如潛艇脫險(xiǎn)、深水作業(yè)減壓上浮、高空飛行或太空艙外活動(dòng))，可引起溶解于組織的生理性惰性氣體溢出形成氣泡導(dǎo)致減壓病(decompression sickness，DCS)的發(fā)生。氣泡栓塞部位的不同可導(dǎo)致皮膚瘙癢、出血、關(guān)節(jié)疼痛甚至呼吸困難、癱瘓、死亡等不同表現(xiàn)。脊髓和肺是DCS氣泡的主要靶器官。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)是治療DCS的重要手段，目前已廣泛應(yīng)用于臨床上一氧化碳

2、中毒、神經(jīng)損傷及糖尿病足等疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)，HBO預(yù)處理可有效預(yù)防脊髓、腦、肝臟等多種組織的缺血缺氧性損傷。我們前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，18h前單次HBO暴露可通過(guò)誘導(dǎo)一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成降低大鼠DCS模型的發(fā)病率。然而，NO水平在HBO暴露結(jié)束后短時(shí)間內(nèi)即恢復(fù)正常，何種機(jī)制介導(dǎo)了HBO暴露18h后的保護(hù)作用尚須深入研究。高壓氧預(yù)適應(yīng)可引起適度的氧化應(yīng)激，通過(guò)動(dòng)員熱休克蛋白70(heat shock protei

3、n 70,HSP70)等保護(hù)性蛋白的生成抵御各類損傷，HSP70除了可發(fā)揮分子伴侶功能和參與細(xì)胞耐熱保護(hù)外，還可通過(guò)抗凋亡、抗氧化等功能對(duì)抗組織細(xì)胞損傷。因此，HSP70很可能作為HBO暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)性蛋白起到預(yù)防DCS的作用。
　　 本課題旨在研究HSP70在HBO預(yù)防DCS損傷中的作用，深入探索HBO預(yù)防DCS的機(jī)制，研究從在體、離體兩方面展開(kāi)，其中在體研究包括以下三方面：
　　 ①研究HBO預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠DCS模

4、型氣泡生成的影響。氣泡生成是DCS發(fā)生的主要因素。在高氣壓暴露前18h分別給予大鼠HBO(280kPa-60min，n=10)或常壓空氣(n=10)預(yù)暴露，隨后以“700kPa-90min空氣暴露、3min減壓”方案制各減壓病模型。通過(guò)超聲二維影像連續(xù)探測(cè)減壓后2h內(nèi)通過(guò)大鼠右心系統(tǒng)的氣泡量，發(fā)現(xiàn)HBO并不影響DCS氣泡生成量及生成速率，提示HBO預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用并不是通過(guò)減少氣泡生成最實(shí)現(xiàn)的。
　　 ②觀察HBO預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠肺

5、與脊髓HSP表達(dá)的影響。SD大鼠以280kPa-60min方案純氧暴露后，分別在暴露后即刻、6、12、18、24、30h(n=6)取肺與脊髓，通過(guò)Western-blot及免疫組化檢測(cè)HSP27、70和90蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)HBO暴露18h后HSP70表達(dá)達(dá)到高峰，隨后下降，HSP27和90變化不顯著。HBO暴露前給予HSP70拮抗劑槲皮素及NO合酶抑制劑L-NAME(NG-nitro-L-arginine-methylester)均可

6、顯著抑制HSP70的表達(dá)，提示HBO通過(guò)NO誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)。
　　 ③探索HSP70在HBO預(yù)防DCS過(guò)程中的作用。以“700kPa-90min空氣暴露、3min減壓”制備大鼠DCS模型，暴露前18h給予常壓空氣、HBO(280kPa-60rain)、HBO+槲皮素、HBO+L-NAME處理(n=60)?？焖贉p壓后1h檢測(cè)肺和脊髓的氧化損傷水平(MDA、8-OHdG、H2O2)及凋亡情況(caspase3、9及TUNEL凋

7、亡細(xì)胞染色)，發(fā)現(xiàn)DCS模型組氧化損傷及凋亡程度較正常對(duì)照明顯升高(P<0.05)，HBO預(yù)暴露顯著降低了這些損傷(P<0.05)，槲皮素及L-NAME顯著拮抗了HBO的保護(hù)效應(yīng)(它們各自單獨(dú)使用對(duì)DCS模型的上述指標(biāo)無(wú)影響)。說(shuō)明HSP70的抗氧化、抗凋亡作用在HBO預(yù)防DCS中發(fā)揮了作用。
　　 上述結(jié)果表明：18h前單次HBO暴露對(duì)大鼠DCS有明顯的預(yù)防作用，此效應(yīng)與HSP70的抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)。
　　 內(nèi)皮

8、是DCS中最先受到氣泡損傷的組織，離體研究以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為對(duì)象，從以下三方面展開(kāi)：
　　 ①觀察HBO預(yù)適應(yīng)對(duì)HUVEC表達(dá)HSP的影響。細(xì)胞以280kPa-60min方案98.2％氧氣及1.8％二氧化碳混合氣暴露(即280kPa下暴露氣體中二氧化碳濃度為5％)，分別在暴露后即刻、6、12、18、24、30、36、42h(n=6)收集細(xì)胞，通過(guò)Western-blot檢測(cè)HSP27、32、70和90蛋白表達(dá)變化，

9、發(fā)現(xiàn)HBO暴露18h后HSP70表達(dá)達(dá)到高峰，HSP27、32和90升高變化不顯著。L-NAME或槲皮素均可顯著抑制HSP70的表達(dá)，提示NO介導(dǎo)了HBO對(duì)HSP70的誘導(dǎo)。
　　 ②HSP70在HBO預(yù)防氧化損傷中的作用。將HUVEC暴露于終濃度為250μmol/L的過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)4h，暴露前18h給予常壓空氣、HBO(280kPa-60 rain)、HBO+槲皮素、HBO+L-NAM

10、E處理(n=6)。H2O2處理后檢測(cè)細(xì)胞氧化損傷程度(MDA、SOD、GSH-Px)及細(xì)胞活力(LDH、CCK8)，結(jié)果表明H2O2明顯地?fù)p傷了HUVEC，其氧化損傷指標(biāo)增高，細(xì)胞活性下降(P<0.05)，HBO預(yù)暴露顯著降低了這些損傷(P<0.05)，槲皮素及L-NAME顯著拈抗了HBO的保護(hù)效應(yīng)(它們各自單獨(dú)使用對(duì)上述指標(biāo)無(wú)影響)。說(shuō)明HSP70的抗氧化作用在HBO預(yù)防細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮了作用。
　　 ③闡明HBO誘導(dǎo)HSP

11、70的分子機(jī)制。細(xì)胞以280kPa-60min方案98.2％氧氣及1.8％二氧化碳混合氣暴露后，分別在暴露后即刻、6、12、18h收集細(xì)胞，通過(guò)信號(hào)蛋白磷酸化芯片檢測(cè)Akt、ATF-2、BCR-Abl、CREB、HSP27、ERK、JNK、p38、NF-κB、p53及STAT3通路磷酸化的表達(dá)程度，結(jié)果表明Akt通路在HBO暴露后12h表達(dá)增高，p38通路在暴露后6h增高，當(dāng)使用p38抑制劑SB203580后，HBO對(duì)HSP70的誘導(dǎo)被

12、拮抗了。Akt通路可介導(dǎo)HSP70的表達(dá)，說(shuō)明HBO產(chǎn)生NO后可通過(guò)p38及Akt通路誘導(dǎo)HSP70表達(dá)增高。
　　 以上結(jié)果說(shuō)明HBO預(yù)適應(yīng)可通過(guò)p38及Akt通路促進(jìn)HSP70表達(dá)，并通過(guò)HSP70的抗損傷作用預(yù)防了內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。
　　 綜上所述，18h前單次高壓氧預(yù)暴露可通過(guò)激活A(yù)kt及p38通路誘導(dǎo)保護(hù)性蛋白HSP70表達(dá)增高，通過(guò)其抗氧化抗凋亡的作用減輕氣泡對(duì)組織損傷，發(fā)揮DCS預(yù)防效應(yīng)。