熱休克蛋白27-70在雙環(huán)醇抗肝損傷保護機制中作用的研究.pdf

1、慢性病毒性肝炎特別是乙型和丙型肝炎的治療是當今世界面臨的一個難題。我國是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，HBsAg攜帶者占我國總人口的8-10％，同時由于乙肝可以通過母嬰垂直傳播，影響下一代，故危害極大。因病毒性肝炎發(fā)展隱匿，且目前尚缺乏有效的治療手段，造成大量的慢性肝病患者長期遷延不愈，其中部分病人經過5-20年會發(fā)展為肝纖維化，部分患者最終出現(xiàn)肝硬化或者肝癌，嚴重威脅病人的生命。肝臟有解毒和清除毒物的功能，同時也是毒物經常攻擊的器官，在解剖上接

2、受肝動脈和門靜脈雙重血液供應。化學物質可通過胃腸道門靜脈或體循環(huán)進入肝臟進行轉化，因此肝臟容易受到化學物中的毒性物質損害。肝細胞損傷是各種肝病共同的病理基礎，其長期存在往往是導致肝纖維化，甚至是肝硬化、肝癌的重要始動因素。因此治療肝細胞損傷是臨床肝病治療的主要環(huán)節(jié)之一。已知多種致病因素可導致肝細胞損傷，如肝炎病毒、酒精和藥物中毒等。肝損傷是一種由多因素介導的復雜的生物學過程，損傷的結果是肝細胞可能發(fā)生凋亡或壞死。通過建立實驗性肝損傷模型

3、，研究肝臟發(fā)病機制，篩選保肝藥物，探索保肝作用機理，具有重要的臨床意義。 熱休克蛋白(HSPs)是進化中高度保守的蛋白家族，其成員在細胞中有組成性和誘導性兩種表達方式。HSPs能幫助維持細胞穩(wěn)態(tài)，提高細胞在惡劣環(huán)境下的生存能力，是細胞防御機制的重要組成部分。體內外研究發(fā)現(xiàn)許多應激因子都能引起HSPs瞬時高表達來保護由應激引起的損傷。HSPs的細胞保護作用主要是由于能與損傷的蛋白質結合，幫助其重新折疊成天然構象。當細胞受到化學性或

4、物理性刺激導致蛋白質變性，HSPs能夠阻止變性蛋白質疏水區(qū)的聚集而提高變性蛋白質的溶解性。雙環(huán)醇(4，4'-Dimethoxy-5，6，5'，6'-bis(methylene-dioxy)-2-hydroxymethy1-2'-methoxycarbonyl bipheny1)是我所自主研發(fā)的抗肝炎新藥，作為一種新型的抗肝炎藥物于2004年批準用于臨床治療慢性病毒性肝炎。本實驗室對雙環(huán)醇的肝臟保護作用進行了大量而充分的研究。先后采用五種

5、不同的實驗性肝損傷動物模型研究研究了雙環(huán)醇的保肝作用，結果表明雙環(huán)醇對CCl4、D-氨基半乳糖(D-GaIN)、撲熱息痛(APAP)、卡介苗加脂多糖和刀豆蛋白A(ConA)引起的小鼠肝損傷均有保護作用。其作用機制包括清除自由基、抑制肝細胞凋亡、保護線粒體、促進肝臟解毒等。臨床應用雙環(huán)醇能降低慢性乙肝病人血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的水平，并兼有一定的抗乙型肝炎病毒的作用，乙型肝炎病毒轉陰率為20％。但是雙環(huán)醇的肝臟保護

6、機制還未完全闡明。內源性HSPs可幫助維持細胞穩(wěn)態(tài)，提高細胞惡劣環(huán)境下的生存能力，有細胞保護作用?；谝陨侠碚摚覀冊O想雙環(huán)醇的肝臟保護作用是否通過誘導HSPs而實現(xiàn)的。為了證實這個設想，我們將從以下三部分進行研究： 1.雙環(huán)醇對小鼠肝臟HSP27/70的誘導作用及對撲熱息痛誘導小鼠肝損傷的保護作用本實驗旨在研究抗肝炎新藥雙環(huán)醇對小鼠肝臟HSPs表達的影響及其在肝損傷中的保護作用。昆明種小鼠在24 h內連續(xù)灌胃雙環(huán)醇200 mg

7、/kg三次，末次給藥后不同時間點取肝臟測定HSPs，發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇可時間依賴性的提高HSP27和HSP70的表達。另外，雙環(huán)醇100，200和300 mg/kg在24h內灌胃小鼠三次，同時給予槲皮素200 mg/kg，末次給藥后6 h取肝臟檢測HSP27和HSP70的表達，結果顯示，雙環(huán)醇劑量依賴性的在蛋白和mRNA水平提高HSP27和HSP70的表達，而槲皮素能抑制雙環(huán)醇對HSP27/70的誘導作用。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇

8、能提高熱休克因子-1(HSFI)的磷酸化和入核。凝膠遷移阻滯實驗結果表明雙環(huán)醇能提高HSF1與熱休克元件(HSE)的結合活性。在APAP造成的小鼠肝損傷模型中研究了雙環(huán)醇誘導HSPs與其保肝作用的關系。小鼠在24 h內灌胃雙環(huán)醇300 mg/kg三次，同時給予槲皮素200 mg/kg，末次給藥后4 h腹腔注射APAP 200 mg/kg，6 h后取肝臟和血清做各項指標的測定。發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇誘導的HSP27和HSP70對APAP引起的小鼠血清

9、ALT/AST的升高、肝細胞凋亡和壞死以及線粒體的損傷均有保護作用。以上結果表明雙環(huán)醇能誘導小鼠肝臟HSP27和HSP70高表達，該作用是通過激活HSF1實現(xiàn)的，雙環(huán)醇的肝臟保護作用與其誘導HSPs高表達有關。本結果為解釋雙環(huán)醇抗肝損傷作用提供了新的理論依據(jù)。 2.雙環(huán)醇對ConA誘導小鼠肝損傷的保護作用與其誘導HSP27/70的關系本實驗主要研究雙環(huán)醇誘導的HSPs能否減輕由ConA引起的肝損傷及相關機制。結果顯示，雙環(huán)醇可時

10、間(200mg/kg)和劑量(100，200，300mg/kg)依賴性的誘導注射ConA小鼠肝臟HSP27和HSP70的表達，雙環(huán)醇對HSP27和HSP70的誘導作用是通過激活HSF1實現(xiàn)的。雙環(huán)醇(300mg/kg)可以減輕由ConA引起的小鼠肝損傷，表現(xiàn)為降低小鼠血清轉氨酶ALT/AST的水平，改善肝細胞凋亡和壞死以及線粒體損傷導致的cytochrome c和凋亡誘導因子(AIF)的外漏。雙環(huán)醇的肝臟保護作用與HSP27和HSP70

11、高表達一致，HSPs合成抑制劑槲皮素能減弱雙環(huán)醇的作用。雙環(huán)醇誘導的HSP27和HSP70可抑制ConA引起的NF-κB通路的激活，表現(xiàn)為HSP70與IκB相互作用抑制IκB的降解，HSP27與IKK相互作用抑制IKK的激活，進而抑制NF-κB p65的核轉位以及與核內DNA的結合活性。HSP27和HSP70還可抑制由ConA引起的JNK和p38的活化。以上結果表明，雙環(huán)醇可通過誘導小鼠肝臟HSP2/70而實現(xiàn)抗ConA所致肝損傷的作用

12、，其保肝作用主要是通過HSP27/70抑制NF-κB和MAPK通路實現(xiàn)的。 3．RNAi技術研究環(huán)醇誘導的熱休克蛋白抗D-氨基半乳糖引起的HepG2細胞凋亡的作用機制上述研究證明雙環(huán)醇具有HSPs誘導作用，并且與其保肝作用密切相關。本實驗采用RNAi技術進一步闡明雙環(huán)醇誘導HSP27/70的作用與其抗肝細胞凋亡的關系。實驗用D-GaIN誘導HepG2細胞凋亡及相關轉導信號的變化觀察雙環(huán)醇的作用。結果顯示雙環(huán)醇(50μM)能時間依

13、賴性的誘導HSP27/70的表達。雙環(huán)醇(25，50和100μM)劑量依賴性的在蛋白和mRNA水平誘導HSP2/70的表達和激活HSF1。MTT結果顯示D-GaIN時間和劑量依賴性的降低HepG2細胞的存活率。應用流式細胞儀PI染色也顯示細胞出現(xiàn)了典型的G-1亞峰，Hoechst33258染色顯示細胞核固縮濃染，或呈碎塊狀、顆粒狀致密濃染，即出現(xiàn)了比較典型的凋亡細胞特征。采用RNAi抑制HSP70表達，發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇誘導的HSP70在D-G

14、aIN誘導HepG2細胞凋亡具有保護作用。此外，雙環(huán)醇誘導的HSP27和HSP70可抑制D-GaIN引起的HepG2細胞caspase-3的活化，NF-κB p65核轉位及DNA結合活性，IKK的磷酸化以及IκB的降解。HSP70可以抑制JNK的磷酸化，而HSP27對JNK的磷酸化抑制作用不明顯。免疫共沉淀結果顯示，HSP27與cytochrome c相互作用，HSP70與Apafl和AIF相互作用，從而抑制D-GaIN引起的HepG2

15、細胞凋亡。以上結果表明雙環(huán)醇對肝細胞損傷具有保護作用，主要是通過誘導HSP27和HSP70實現(xiàn)的。HSP27和HSP70主要通過抑制NF-κB和JNK凋亡信號轉導通路，與凋亡通路中重要的蛋白質如cytochrome c、Apaf1和AIF結合，抑制caspase-3的活化，在肝細胞凋亡中發(fā)揮重要的保護作用。 結論：1.雙環(huán)醇可激活HSPs合成的重要轉錄因子HSF1，啟動熱休克基因的轉錄，誘導小鼠肝臟HSP27和HSP70的高表達