雙環(huán)醇對CpG-ODN誘導的肝損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、病毒性肝炎(virushepatitis)傳染性強，發(fā)病率高，流行范圍廣，是全球最主要的傳染病之一。病毒性肝炎肝損傷主要由免疫介導，在肝臟局部，肝細胞受HBV感染后激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生炎癥與化學趨化因子，將炎癥、淋巴細胞活化并募集至肝臟，這些炎癥和淋巴細胞的浸潤如果導致過強的免疫反應，則最終引起肝組織的損傷。因此，調(diào)節(jié)機體免疫反應和抑制肝臟炎癥是乙型肝炎治療的重要策略之一。 雙環(huán)醇(6—甲氧羰基-6’—羥甲基-2，3，2’，3’—

2、二亞甲基二氧基-4，4’—二甲氧基聯(lián)苯)由中國醫(yī)學科學院藥物研究所劉耕陶院士和張純貞教授合作的科研小組歷經(jīng)15年艱辛研制成功，該藥降低轉(zhuǎn)氨酶作用顯著，對肝細胞具有較好的保護作用，并具有抗肝纖維化的作用，長期使用無明顯不良反應。雙環(huán)醇的問世為病毒性肝炎的治療提供了一種新的安全、有效的輔助治療藥物，其藥理基礎(chǔ)和作用機制均值得繼續(xù)深入研究。迄今為止，已有大量動物實驗證明，雙環(huán)醇對四氯化碳(CCl4)、D—氨基半乳糖、對乙酰氨基酚、脂多糖(LP

3、S)和刀豆蛋白A(ConA)等化學物質(zhì)誘導的肝損傷均有保護作用，作用機制涉及抑制氧化和免疫損傷、細胞凋亡和細胞膜穩(wěn)定等。但尚缺乏雙環(huán)醇對病毒感染造成的肝臟炎癥的保護作用及其機制的研究。 近年來關(guān)于病原體相關(guān)分子模式(Pathogen—associatedmolecularpatterns，PAMPs)的研究進展表明，激活高等動物天然免疫應答的PAMPs廣泛存在于病原體細胞表面，識別PAMPs是以模式識別受體(Patternrec

4、ognitionreceptors，PPRs)，Toll樣受體(Toll—likereceptors，TLRs)介導的。細菌和病毒的DNA作為一種PAMPs能被機體識別并激發(fā)免疫應答，是因為其基因組中的一段以非甲基化CpG二核苷酸為核心的高保守序列，即CpG基序(CpGmotif)。機體免疫系統(tǒng)通過TLR9(Toll—likereceptor9)特異識別細菌和病毒DNA中的CpG基序并形成受體復合物后，通過髓性分化因子88(myeloi

5、ddifferentiationfactor88，MyD88)依賴途徑，激活NF—κB(nuclearfactor—κB)通路和應激酶通路等信號轉(zhuǎn)導通路，促進機體產(chǎn)生Th1型細胞應答和分泌炎癥因子，當炎癥因子過度釋放時，則造成宿主的炎癥或損傷。研究證實人工合成的含一個或數(shù)個非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核糖核酸(CpGoligodeoxynucleotides，CpG—ODNs)，也具有和細菌及病毒DNA中CpG基序一樣的免疫刺激效應。因

6、此，CpG—ODNs可用以模擬細菌和病毒等微生物病原侵入機體所引發(fā)的免疫反應狀態(tài)，構(gòu)建相應的疾病模型。 目前已有研究小組構(gòu)建了CpG—DNA/LPS以及CpG—DNA/D—GalN誘導的小鼠肝損傷模型，為我們進一步研究病毒感染后的肝臟炎癥免疫病理提供了可能的模型。本研究中，我們用CpG—ODN/D—GalN造成小鼠肝損傷，模擬小鼠感染DNA病毒后所引起的肝臟炎癥反應，來研究雙環(huán)醇的保護作用和機制。根據(jù)CpG—ODN的免疫活性具有

7、種屬特異性的特征，第一部分研究中，我們以對小鼠具有最佳免疫效果的CpG1826構(gòu)建小鼠肝損傷模型；第二部分研究中，則以對人類最具免疫效應的CpG2006模擬病毒刺激人正常細胞株L02細胞，從整體動物和離體細胞兩個水平研究雙環(huán)醇對CpG—ODN造成的免疫性炎癥的保護作用，及其對TLR9介導的信號通路分子的活化和細胞因子分泌的作用。 方法：用不同濃度雙環(huán)醇(0.01，0.1，0.5mM)與L02細胞溫孵2小時后，加入濃度為10μg/

8、mlCpG—ODN2006，繼續(xù)培養(yǎng)18小時，模型組僅加入10μg/mlCpG—ODN2006。用ELIDA法測定培養(yǎng)上清中17NF—α、和IL-18及趨化因子MCP-1，RANTES和MIP-1α等水平；Westernblot法和流式細胞術(shù)測定L02細胞內(nèi)TLR9的表達；Westernblot法測定細胞內(nèi)p—NF—κBp65、p—p38—MAPK，pErk1/2-MAPK的變化。 結(jié)果：雙環(huán)醇能夠劑量依賴性地抑制CpG—ODN

9、誘導的L02細胞趨化因子的釋放和TNF—α等細胞因子的分泌，其中雙環(huán)醇0.5mM組和模型組相比，TNF—α、IL-18、MCP-1、MIP-1α和Rantes分別降低77.9％，88.7％，74.6％，63.3％和64.0％。Wersternblot和流式細胞術(shù)結(jié)果一致表明，雙環(huán)醇0.5mM和0.1mM能夠下調(diào)L02細胞內(nèi)經(jīng)ODN誘導表達的TLR9，同時，還能抑制相關(guān)NF—κB通路蛋白p65和MAPK通路相關(guān)蛋白p38及ERK1/2的磷

10、酸化。 結(jié)論：雙環(huán)醇能明顯抑制CpG—ODN誘導的人肝細胞株L02炎癥因子和趨化因子的釋放與分泌，并且抑制L02細胞內(nèi)TLR9的表達及相關(guān)NF—κB和MAPK．信號傳導途徑分子的磷酸化活性。 綜上，本課題首次研究了雙環(huán)醇對CpG—ODN誘導的小鼠肝損傷的保護作用，并從整體動物水平和離體細胞水平研究了雙環(huán)醇對肝細胞的保護作用機制。結(jié)果表明，雙環(huán)醇能顯著降低CpG—ODN誘導上升的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶并改善肝臟病理情況。其機制可能

11、與雙環(huán)醇既參與機體的免疫調(diào)節(jié)，又對肝細胞有直接的保護作用有關(guān)。雙環(huán)醇在體內(nèi)能抑制小鼠血清和肝組織中炎癥因子(TNF—α，IL-18，IFN—γ)和趨化因子MCP-1，MIP-1α，和RANTES的水平；同時也能直接抑制體外培養(yǎng)的L02細胞分泌這些因子。同時，雙環(huán)醇還能下調(diào)L02細胞內(nèi)TLR9的表達及其信號途徑所涉及的信號轉(zhuǎn)導分子如NF—κB—p65，MAPK—p38和ERK1/2的活化。因此，雙環(huán)醇可以從多途徑減輕CpG—ODN對肝臟造