雙環(huán)醇對Con A肝損傷小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導通路影響;雙環(huán)醇對順鉑中毒小鼠腎臟及肝臟損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)現(xiàn)于干擾素的信號轉(zhuǎn)導研究中，是細胞因子信息內(nèi)傳的一條重要通道，涉及免疫、炎癥等多種生理、病理過程。MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路在體內(nèi)多種生長因子的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用，不僅參與細胞增殖信號傳遞，也是調(diào)控細胞炎癥和應激信號的重要蛋白。 雙環(huán)醇(商品名：百賽諾，Bicyclol；化學名：4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-雙(亞甲二氧基)-2-羥甲基-2’-甲氧羰基聯(lián)苯)是中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制的

2、抗肝炎新藥。前期藥理研究表明，雙環(huán)醇對多種化學性和免疫性肝損傷均有較強的保護作用，其肝保護作用機制與抑制氧化損傷及炎癥因子調(diào)控密切相關。但雙環(huán)醇上述作用與JAK/STAT及MAPKs細胞信號轉(zhuǎn)導通路關系尚不完全明了。 本研究擬觀察免疫性(ConA)肝損傷及HBVDNA轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟JAK/STAT細胞信號通路變化，以及雙環(huán)醇對JAK/STAT細胞信號通路調(diào)控作用。同時本研究觀察雙環(huán)醇對順鉑引起肝腎損傷的保護作用及機制。

3、第一部分雙環(huán)醇對ConA肝損傷小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟細胞信號轉(zhuǎn)導通路影響 1.雙環(huán)醇對ConA肝損傷小鼠肝臟TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1信號轉(zhuǎn)導通路影響本研究應用ConA免疫性肝損傷動物模型，觀察病理狀態(tài)下TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1信號轉(zhuǎn)導通路對相關細胞因子的調(diào)控及雙環(huán)醇對TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1的影響，進一步探討雙環(huán)醇調(diào)控肝臟免疫炎癥因子表達失衡的分子機制。

4、 小鼠尾靜脈注射ConA(25mg/kg)可引起急性肝損傷，表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶升高及肝組織出現(xiàn)嚴重壞死及炎癥細胞浸潤。雙環(huán)醇口服給藥(200mg/kg，qd×4)可顯著降低ConA引起的小鼠血清ALT及AST異常增高，肝組織形態(tài)學改變也明顯改善。 ConA引起肝損傷的發(fā)病機制中，炎癥因子的水平升高是產(chǎn)生損傷的主要因素。注射ConA后，小鼠血清炎癥因子TNF-α及IFN-γ水平顯著升高，分別于2h及8h達峰。雙環(huán)醇預防給藥可抑制C

5、onA引起的血清TNF-α及IFN-γ水平升高，并下調(diào)IFN-γmRNA在肝組織的表達。 IKB的降解及NF-κB表達上調(diào)是TNF-α信號轉(zhuǎn)導通路的重要環(huán)節(jié)?；罨腘F-κB可通過誘導iNOS表達，產(chǎn)生大量NO，導致肝細胞損傷。ConA注射后1h，小鼠肝臟IκB水平即有降低，NF-κB水平同時升高，導致小鼠肝臟iNOS水平升高，血清NO含量增加。雙環(huán)醇可抑制ConA肝損傷小鼠肝臟IκB降解和NF-κB表達升高，下調(diào)肝臟iNOS水

6、平，從而顯著抑制血清NO異常升高。 在IFN-γ介導的免疫性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中，IFN-γ主要通過誘導STAT-1同源二聚體的生成而參與信號轉(zhuǎn)導。小鼠注射ConA后，肝臟pSTAT1水平升高，其信號轉(zhuǎn)導的下游因子IRF-1和負反饋抑制因子SOCS1表達也同時上調(diào)。雙環(huán)醇在保護肝損傷的同時可抑制小鼠肝臟pSTAT1及IRF-1的表達，同時，進一步上調(diào)肝臟SOCS1表達。已知黏附分子ICAM-1/LFA-1可介導肝臟炎性反應時的細

7、胞黏附，導致肝細胞損傷。小鼠注射ConA后，肝組織ICAM-1及其受體LFA-1的表達明顯增加，雙環(huán)醇可明顯抑制上述細胞因子在肝組織的異常表達。 本研究還采用基因芯片技術研究雙環(huán)醇口服給藥對小鼠肝臟基因表達譜的影響。結(jié)果表明，雙環(huán)醇給藥后小鼠肝臟287條基因發(fā)生差異表達，占芯片基因總數(shù)的7％，其中表達下調(diào)基因166條，上調(diào)基因121條。差異表達的基因涉及代謝、離子通道及細胞色素P450相關基因45條；炎癥與應激、凋亡相關基因32

8、條；免疫相關基因11條：細胞周期調(diào)控、信號傳導及再生相關基因27條；疾病特異表達基因與原癌基因14條；其他功能基因26條。上述結(jié)果將為后續(xù)研究提供參考。 本研究結(jié)果表明，雙環(huán)醇對ConA引起肝損傷的保護作用機制與下調(diào)炎癥因子TNF-α、IFN-γ水平，抑制STAT1磷酸化及上調(diào)STAT1的負反饋抑制因子SOCS1的表達，阻斷IFN-γ信號轉(zhuǎn)導密切相關。雙環(huán)醇還可通過抑制IκB降解及NF-κB活化而降低iNOS表達，繼而減少Con

9、A引起的NO水平升高。 2.雙環(huán)醇對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBVDNA復制及JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路的影響 已知抗肝炎病毒藥物除可直接抑制HBVDNA聚合酶，還可通過活化NKT細胞和CTL細胞功能，誘導干擾素合成，和/或活化干擾素信號轉(zhuǎn)導通路，促進抗病毒蛋白的合成。上述兩種途徑都涉及到干擾素信號轉(zhuǎn)導通路蛋白(JAK/STAT)的活化和轉(zhuǎn)位。本研究應用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及HepG2.2.1.5細胞研究雙環(huán)醇對HBVDNA復

10、制影響與JAK/STAT信號通路的關系。 研究結(jié)果表明，雙環(huán)醇可降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBVDNA水平(5×103copies/mlvs6×105copies/ml)。此外，雙環(huán)醇對HepG2.2.1.5HBVDNA復制也有一定抑制作用(1.5×105copies/mlvs4.5×105copies/ml)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清IFN-γ水平及肝臟pSTAT1/3，IRF-1表達未見顯著變化，雙環(huán)醇對上述指標亦無

11、影響。 上述結(jié)果提示，雙環(huán)醇對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBVDNA復制有一定抑制作用，但此作用與調(diào)控JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路無明顯相關性。 第二部分雙環(huán)醇對順鉑中毒小鼠肝臟及腎臟損傷的保護作用及機制研究順鉑是臨床上常用的廣譜抗癌藥，但其導致的肝腎損傷影響其臨床應用和療效，目前尚無滿意的治療藥物。本研究模擬臨床常規(guī)的給藥方式，建立了順鉑引起小鼠肝、腎損傷的實驗動物模型，研究雙環(huán)醇對順鉑肝腎損傷的保護作用及分子機制，并觀察雙環(huán)醇

12、在保護順鉑肝腎毒性的同時對順鉑抗腫瘤作用的影響，為臨床應用提供有價值的實驗依據(jù)。 雙環(huán)醇對順鉑引起的肝腎損傷具有較好的保護作用，不僅可明顯降低順鉑引起的血清CRE/BUN和轉(zhuǎn)氨酶的升高，腎臟和肝臟病理損傷也明顯減輕。 小鼠腹腔注射順鉑后，肝臟與腎臟抗氧化物SOD，CAT及GSH-px活性均顯著降低，GSH含量也顯著下降，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA顯著升高。雙環(huán)醇可抑制肝腎組織內(nèi)MDA的升高和GSH的下降，SOD、CAT及GS

13、H-px活性也明顯改善。同時，雙環(huán)醇可阻斷順鉑中毒小鼠肝臟iNOS的表達升高，降低肝臟NO水平，抑制肝臟3-NT的過表達。此外，雙環(huán)醇可阻斷順鉑引起肝臟ERK1/2、Elk-1、p38MAPK、p53的磷酸化及calpain異常激活。雙環(huán)醇在保護順鉑引起肝腎損傷的同時，對順鉑的抑瘤率無明顯影響(H22腫瘤抑制率：順鉑單用85.7％，與雙環(huán)醇250mg/kg合用83.5％)。 由此可見，雙環(huán)醇對順鉑引起肝腎損傷的保護作用可歸納為抑

14、制氧化損傷，恢復抗氧化物水平達到細胞保護作用。同時，雙環(huán)醇可抑制順鉑引起的肝臟iNOS表達上調(diào)，降低NO水平從而抑制氧化與硝化應激，阻斷蛋白質(zhì)硝基化。雙環(huán)醇抑制氧化與硝化應激與調(diào)控肝臟p38MAPK及ERK1/2活化及其下游因子激活密切相關。 綜上所述，雙環(huán)醇對上述免疫性和藥物性肝損傷的保護作用與JAK/STAT及MAPKs細胞信號轉(zhuǎn)導通路關系可歸納如下： 1.雙環(huán)醇可通過調(diào)控TNF-α/NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路，抑制Iκ

15、B降解及NF-κB活化，從而降低ConA引起的小鼠肝臟iNOS表達上調(diào)及NO生成。 2.雙環(huán)醇可抑制ConA引起的STAT1及其下游前凋亡因子IRF-1的活化，上述作用是通過上調(diào)SOCS1實現(xiàn)。 3.雙環(huán)醇對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠及HepG2.2.1.5細胞HBVDNA復制的抑制作用與JAK/STAT細胞信號轉(zhuǎn)導通路無關。 4.雙環(huán)醇對順鉑引起的小鼠肝腎損傷均有明顯的保護作用，上述作用與雙環(huán)醇抑制順鉑引起的肝腎氧化/硝

16、化應激相關。 5.雙環(huán)醇對順鉑肝腎損傷的保護作用與調(diào)控ERK1/2及p38MAPK及其下游因子有關。 6.雙環(huán)醇在保護順鉑中毒小鼠肝、腎損傷的同時不影響順鉑對H22實體瘤的抑制作用。 本研究從保護免疫性和藥物性肝損傷的角度進一步豐富了對雙環(huán)醇作用分子機制的了解，發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇可通過抑制炎癥因子表達及抗氧化/硝化應激而保護肝細胞損傷，其保護機制與調(diào)控JAK/STAT及MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路密切相關。上述結(jié)果為臨床適應癥