熱休克蛋白47在日本血吸蟲肝纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　肝纖維化(hepatic fibrosis)是機(jī)體對(duì)慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng),是病毒性肝炎、血吸蟲肝病及酒精性肝炎等慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段,也是多種慢性肝臟疾病最終導(dǎo)致肝功能衰竭的主要病理改變和共同通路。延緩和防止肝纖維化是防治慢性肝臟病進(jìn)展的關(guān)鍵。全球大約2億人口受血吸蟲病威脅,目前我國(guó)仍有12省有新發(fā)日本血吸蟲病病例報(bào)道,日本血吸蟲所致肝硬化仍嚴(yán)重影響人們的生活及健康。肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)(Extra

2、cellular matrix, ECM)增生和降解不平衡,導(dǎo)致可逆性積累的結(jié)果。大量研究支持肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　生理?xiàng)l件下 HSCs處于靜息狀態(tài),當(dāng)肝臟受到各種病因(如血吸蟲蟲卵誘發(fā)的IV型超敏反應(yīng))刺激時(shí),HSC的表型和功能會(huì)發(fā)生變化,如脂滴、維生素 A丟失、某些蛋白表達(dá)增加如a-平滑肌蛋白(α-Smooth muscle act

3、in,α-SMA)、突觸素(synaptophysin, syn)、熱休克蛋白47(heat shock protein,HSP47),并釋放一些細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)等,通過(guò)細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)放大作用促進(jìn)自身進(jìn)一步活化。自身進(jìn)一步活化后,HSCs所發(fā)揮的功能效應(yīng)主要表現(xiàn)為

4、合成和分泌含有大量膠原纖維(Ⅰ和Ⅲ型膠原)的ECM。調(diào)節(jié) ECM降解的酶類主要有基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)與組織金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs),TIMPs是抑制MMPs活性的一組多功能因子家族, MMPs與 TIMPs以1∶1的比例形成 MMP-TIMP復(fù)合體,阻斷 MMPs與膠原底物結(jié)合,從而抑制MMPs的活

5、性,降低膠原的降解。在肝纖維化生成和進(jìn)展中纖溶系統(tǒng)有雙重作用:其一,降解竇周間隙細(xì)胞外基質(zhì),破壞細(xì)胞之間的正常聯(lián)系而促進(jìn) HSCs的增殖和遷移;其二,通過(guò) TGF-β1的活化,上調(diào) PAI-1和TIMPs的合成,從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積,并且抑制纖溶酶的生成和基質(zhì)降解。
　　HSP47(heat shock protein47,HSP47)是機(jī)體受到應(yīng)激后合成增加的應(yīng)激蛋白,主要存在于膠原合成細(xì)胞(如肝星狀細(xì)胞)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,

6、已發(fā)現(xiàn)在多種疾病纖維化病理過(guò)程中HSP47上調(diào)與膠原的合成和纖維化進(jìn)展在時(shí)間和分布上呈正相關(guān),抑制HSP47的表達(dá),可以抑制膠原合成及抑制組織纖維化,而與肝纖維化關(guān)系的研究目前尚處于探索階段。熱休克蛋白47在血吸蟲病肝纖維化過(guò)程中扮演的角色和作用尚未見報(bào)道,尤其對(duì)活化 HSC功能效應(yīng)的影響研究甚少。
　　基因水平干預(yù)―有害‖基因高表達(dá)可以更好地闡明該基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中重要作用,也為探索肝纖維化臨床治療方法提供了新的思路。研究發(fā)

7、現(xiàn),尾靜脈高壓注射可以使質(zhì)粒-DNA在小鼠肝臟獲得高效表達(dá)。尾靜脈高壓注射,可延長(zhǎng)質(zhì)粒-DNA在肝竇中的停留時(shí)間,此外,多數(shù)藥物的首關(guān)代謝在肝臟進(jìn)行,質(zhì)粒-DNA被肝組織細(xì)胞攝取。利用該方法針對(duì)HSP47基因進(jìn)行干預(yù)后對(duì)血吸蟲肝纖維化病程的影響,進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制有重要意義。
　　第一部分 HSP47在日本血吸蟲病肝纖維化組織中的表達(dá)
　　目的：
　　觀察 HSP47在臨床日本血吸蟲病肝臟組織中的表達(dá)情況及血吸蟲病肝

8、纖維化小鼠動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)變化,旨在探討 HSP47在肝纖維化進(jìn)程中的作用。
　　方法：
　　1.收集2008年～2011年間同濟(jì)醫(yī)院門診和住院部的部分血吸蟲病肝纖維化患者肝穿標(biāo)本及臨床資料48例。免疫組織化學(xué)及Real-time PCR檢測(cè) HSP47、TGF-β1、CTGF及I型膠原的表達(dá),HE染色和Masson染色觀察病理改變和膠原纖維沉積狀況。
　　2.將血吸蟲尾蚴(20±1)經(jīng)腹部皮膚感染 Balb/c小鼠,

9、建立實(shí)驗(yàn)性血吸蟲病肝纖維化小鼠模型,同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。分別在感染后第6周及12周取小鼠肝臟, HE及Masson染色觀察病理改變,免疫組織化學(xué)和Real-time PCR檢測(cè) HSP47、TGF-β1和I型膠原的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與正常對(duì)照組比較,S2期肝纖維化小鼠匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)有大量纖維組織增生和纖維沉積,至 S4期時(shí),肝小葉結(jié)構(gòu)已被破壞,同時(shí)中心靜脈區(qū)和匯管區(qū)出現(xiàn)纖維間隔。Masson染色結(jié)果顯示:與對(duì)照組比

10、較,肝纖維化組組織中膠原在肝間質(zhì)區(qū)顯著增多,且肝組織內(nèi)膠原含量隨纖維化分級(jí)同步增高。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,肝纖維化組織中HSP47及肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志(α-SMA)表達(dá)亦顯著增加,且在匯管區(qū)、間質(zhì)區(qū)發(fā)生纖維化區(qū)域明顯;TGF-β1表達(dá)顯著增加,其主要集中在炎癥浸潤(rùn)、纖維化形成區(qū)。
　　3.選取 S0-S4期患者肝活檢組織,Real time PCR檢測(cè) HSP47-mRNA表達(dá),隨肝纖維化進(jìn)展逐漸增加,且

11、于 S3期達(dá)高峰,于 S4期略下降,但二者與 S0期 HSP47的表達(dá)相比較,仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí),分析肝活檢組織病理炎癥分級(jí)與 HSP47表達(dá)的關(guān)系,無(wú)明顯相關(guān)性。
　　4.TGF-β1、CTGF、Collagen I在血吸蟲病肝纖維化患者不同纖維化分期中的表達(dá):實(shí)驗(yàn)結(jié)果示 TGF-β1在肝纖維化 S1期即有表達(dá),且 S2期與 S1期相比,差異具有顯著性;CTGF在肝纖維化 S2-S4期中分別與 S0期相比,均顯著增加;肝組織內(nèi)

12、 I型膠原含量與肝纖維化分級(jí)一致,S1-S4期與 S0期相比,其表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.日本血吸蟲小鼠ALT和AST水平于感染第6周達(dá)到高峰,與感染前相比,均顯著增高,達(dá)峰值后開始回落,至感染第12周基本接近感染前的水平。小鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變:感染第6W,肝組織 HE及Masson染色均可見蟲卵沉積,至感染第12W,肝組織 HE染色可見纖維組織沿蟲卵肉芽腫呈干線性生長(zhǎng),Masson染色示大量藍(lán)色膠原纖維沉積。
　　6.

13、日本血吸蟲小鼠肝組織 HSP47-mRNA于感染第6W、8W、12W表達(dá)較感染前均顯著升高(p<0.01),并在感染第8周達(dá)峰值,后有所回落,但仍高于正常表達(dá)。Western-blot檢測(cè) HSP47隨感染后纖維化進(jìn)展,其表達(dá)逐漸增加(p<0.01)。
　　結(jié)論：
　　HSP47及TGF-β1、CTGF在臨床肝纖維化和血吸蟲動(dòng)物模型組織中表達(dá)上調(diào),且 HSP47與膠原表達(dá)部位一致, HSP47促纖維化作用與其增加膠原蛋白合成

14、有密切關(guān)系,且 TGF-β1、CTGF網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)參與血吸蟲肝纖維化的進(jìn)程
　　第二部分 HSP47-shRNA的構(gòu)建及其細(xì)胞水平對(duì) HSP47表達(dá)的影響
　　目的：
　　針對(duì)肝纖維化發(fā)病關(guān)鍵基因構(gòu)建 HSP47-ShRNA,初步驗(yàn)證其能否在體外 NIH/3T3細(xì)胞系干預(yù) HSP47基因的表達(dá),并觀察其對(duì)該細(xì)胞功能學(xué)的影響。
　　方法：
　　1.設(shè)計(jì) HSP47-shRNA模板,并將其分別設(shè)計(jì)于 U6啟動(dòng)子的下

15、游引物,將 U6啟動(dòng)子及其下游 HSP47-shRNA的模板雙鏈 DNA裝入載體,構(gòu)建 pGCsi-U6/Neo/HSP47-shRNA。
　　2.細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染 HSP47-shRNA與非相關(guān)干擾質(zhì)粒作為對(duì)照,分別于24h、48h收集細(xì)胞,采用Real-time PCR、Western-blot技術(shù)檢測(cè) HSP47 mRNA及蛋白水平表達(dá);Real-time PCR和ELISA法檢測(cè) TGF-β1。同時(shí)觀察對(duì)該細(xì)胞分泌膠原功能的影

16、響。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建 HSP47-shRNA載體,通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入 NIH/3T3細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率約60％。轉(zhuǎn)染12h,可見少量綠色熒光細(xì)胞,隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞熒光表達(dá)量逐漸增加,各干擾質(zhì)粒于轉(zhuǎn)染72h熒光表達(dá)最強(qiáng)。
　　2.ShRNA干擾顯著抑制HSP47的表達(dá),且 ShRNA-HSP47-1于轉(zhuǎn)染24h對(duì) HSP47的沉默效率最佳,為(25.83±1.794)％。TGF-β1,隨 HSP47表達(dá)

17、下調(diào),有一定程度抑制,與未干預(yù)空白組及非相關(guān)對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.HSP47經(jīng)干預(yù)后,NIH/3T3細(xì)胞膠原合成和分泌明顯減少,且以 ShRNA-HSP47-1轉(zhuǎn)染24h抑制最明顯,與空白組比較有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了HSP47-shRNA干擾質(zhì)粒,并初步證實(shí)其對(duì) HSP47的表達(dá)干預(yù)有效,為進(jìn)一步的體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分 HSP47-shRNA對(duì)血吸蟲尾蚴誘導(dǎo)的鼠

18、肝纖維病程的干預(yù)作用
　　目的：
　　觀察 HSP47-shRNA血吸蟲肝纖維化小鼠體內(nèi) HSP47的表達(dá)及對(duì)引起肝纖維化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,最終明確 HSP47對(duì)血吸蟲小鼠肝纖維化病情發(fā)展的影響。
　　方法：
　　1.建立日本血吸蟲感染小鼠的動(dòng)物模型,于感染第6W經(jīng)尾靜脈高壓注射,1次/周,體內(nèi)轉(zhuǎn)染 HSP47-shRNA,干預(yù)至感染第14W,檢測(cè)目的基因在肝臟的體內(nèi)表達(dá)效率;
　　2.將 HSP47-

19、shRNA通過(guò)尾靜脈高壓注射后,觀察小鼠生存率,并于感染第6W、8W、14W動(dòng)態(tài)記錄脾臟指數(shù)、肝組織大體、血清生化學(xué)改變、肝組病理學(xué)改變。
　　3.取感染第6W、8W、14W肝組織石蠟切片行天狼星紅-苦味酸染色,偏振光顯微鏡下閱片,利用Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件對(duì)肝組織總膠原及I、III型膠原定量。
　　4.通過(guò) Real-Time PCR、免疫組化、ELISA、Western-blot等技術(shù)檢測(cè)各干預(yù)組

20、間HSP47表達(dá)下調(diào)情況,以及其干預(yù)后對(duì)膠原合成、細(xì)胞因子(TGF-β1、CTGF、IL-13、IL-17、MMP-9、TIMP-1及PAI-1)表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度 HSP47-shRNA對(duì)血吸蟲病肝纖維化小鼠模型干預(yù)至感染第14W,高、中、低劑量組生存率分別為33.33％、25％、25％,非相關(guān)對(duì)照組為16.67％。
　　2.HE染色示肝纖維化較對(duì)照組明顯減輕;Masson染色提示:肝內(nèi)膠原沉

21、積較對(duì)照組明顯減少。
　　3.干預(yù) HSP47表達(dá)后,與 PBS組及非相關(guān)對(duì)照組相比,IL-13、IL-17、TGF-β、CTGF、TIMP-1下降顯著,MMP-9、PAI-1升高明顯,差別均具有顯著性(p<0.05);星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志(a-SMA)表達(dá)明顯降低;肝內(nèi)膠原蛋白(collagenI/III)明顯減少。
　　結(jié)論：
　　干預(yù) HSP47表達(dá),可以明顯改善肝纖維化,HSP47除了可以影響膠原蛋白的表達(dá),還涉