日本血吸蟲熱休克蛋白超家族及其在尾蚴入侵階段應(yīng)激反應(yīng)的初步分析研究.pdf

1、自古以來，血吸蟲病作為一種經(jīng)疫水傳播的疾病不斷地危害人類的健康，它的病原生物血吸蟲有著特殊的傳播過程和感染過程，在血吸蟲的生活史中，螺和哺乳動(dòng)物分別是它的中間宿主和終宿主，在血吸蟲感染宿主及在宿主體內(nèi)發(fā)育繁殖的過程中，血吸蟲需要具備識(shí)別，入侵，抗應(yīng)激的能力。
　　血吸蟲是多細(xì)胞的動(dòng)物，隸屬于吸蟲，雌雄異體，寄生生活。在寄生過程中，宿主可以產(chǎn)生對(duì)蟲體的抵抗作用。研究表明，在流行區(qū)人群對(duì)血吸蟲具有一定的免疫保護(hù)力;東方田鼠可以對(duì)血吸蟲

2、完全抵抗;易感動(dòng)物對(duì)致弱尾蚴免疫感染后可產(chǎn)生對(duì)再次感染的抵抗作用。宿主的免疫對(duì)于血吸蟲生存是一個(gè)挑戰(zhàn)。
　　血吸蟲的抗應(yīng)激與宿主的免疫攻擊是研究不同結(jié)局的重要因素，對(duì)于這方面的闡述和研究將有助于更深入的了解宿主與血吸蟲的相互關(guān)系。
　　一、日本血吸蟲熱休克蛋白及其在正常尾蚴和致弱尾蚴的表達(dá)差異
　　目的：
　　致弱尾蚴初次免疫小鼠后能夠產(chǎn)生對(duì)于再次感染的抵抗能力，這跟致弱尾蚴經(jīng)紫外線照射后某些分子或者結(jié)構(gòu)的變化可

3、能有關(guān)系，熱休克蛋白在血吸蟲的自我防御中發(fā)揮著重要的作用。本章節(jié)研究血吸蟲的熱休克蛋白系統(tǒng)，同時(shí)研究熱休克蛋白在正常尾蚴和致弱尾蚴當(dāng)中表達(dá)量的改變，以期能夠探索致弱尾蚴免疫效果的機(jī)制。
　　方法：
　　1、通過搜索KEGG數(shù)據(jù)庫，找出HSPs參與的主要的生物學(xué)通路和生物學(xué)過程;
　　2、在日本血吸蟲中，充分挖掘NCBI當(dāng)中日本血吸蟲的熱休克蛋白的基因序列;
　　3、依據(jù)是按照分子量的大小，序列的結(jié)構(gòu)域分析及細(xì)胞的

4、不同部位對(duì)日本血吸蟲的熱休克蛋白進(jìn)行分類;用MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比較熱休克蛋白的分子進(jìn)化，比較日本血吸蟲，曼氏血吸蟲，秀麗隱桿線蟲，小鼠和人之間熱休克蛋白的同源關(guān)系;
　　4、通過特定的紫外光的照射，構(gòu)建日本血吸蟲致弱尾蚴的模型，分別用正常尾蚴和致弱尾蚴感染小鼠皮膚，在兩個(gè)不同的時(shí)間（感染后1小時(shí)和感染后2.5小時(shí)）取下皮膚，用感染了血吸蟲的小鼠皮膚來進(jìn)行RNA的提取和后續(xù)的實(shí)驗(yàn);

5、　　5、按照熱休克蛋白的家族分類和它們分布的不同細(xì)胞部位，挑選了十二個(gè)重要的熱休克蛋白及熱休克因子，用qPCR來觀察它們?cè)谡Ｎ豺矢腥拘∈笃つw和致弱尾蚴感染小鼠皮膚后表達(dá)量的變化;
　　6、制備血吸蟲感染皮膚樣本的石蠟切片，HE染色觀察皮膚期童蟲在正常和致弱組中形態(tài)的變化，進(jìn)一步用間接免疫熒光技術(shù)看SjP40在尾蚴當(dāng)中的表達(dá)和定位情況;
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

6、br>　　結(jié)果：
　　1、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲有著眾多的熱休克蛋白，這些熱休克蛋白可以分為HSP70家族，HSP90家族，HSP40家族，小熱休克蛋白家族，HSP60和HSP10;家族內(nèi)部有分布在不同細(xì)胞部位的熱休克蛋白分子。同時(shí)日本血吸蟲也有HSF。
　　2、熱休克蛋白70家族根據(jù)結(jié)構(gòu)域、功能及細(xì)胞定位的不同，可以分為HSPA5、HSPA8、HSPA9及HSP110;熱休克蛋白90家族根據(jù)結(jié)構(gòu)域、功能及細(xì)胞定位的不

7、同可以分為HSP83，Gp96和TRAP。
　　3、日本血吸蟲的熱休克蛋白跟曼氏血吸蟲的熱休克蛋白同源性比較接近，其次是宿主小鼠和人，最后是秀麗隱桿線蟲。
　　4、正常尾蚴和致弱尾蚴入侵小鼠皮膚后熱休克蛋白都會(huì)升高，但是致弱尾蚴升高的幅度比正常尾蚴的要小，特別是在基礎(chǔ)表達(dá)量高的基因如HSPA8，P40和HSP90中，它們之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、致弱尾蚴經(jīng)過紫外線照射后，蟲體的形態(tài)有所改變。
　　結(jié)論：<

8、br>　　1、日本血吸蟲擁有完整的熱休克蛋白體系，它們分布于不同部位，有著不同的功能，能夠通過相互作用組成一個(gè)應(yīng)激的整體，發(fā)揮著蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，折疊，修復(fù)，降解的功能，這是日本血吸蟲抵抗外界刺激和宿主攻擊的基礎(chǔ)。
　　2、正常尾蚴和致弱尾蚴在熱休克蛋白的表達(dá)上，兩者在入侵小鼠皮膚時(shí)都會(huì)升高，但致弱尾蚴升高的幅度沒有正常的大，這可能會(huì)影響到熱休克蛋白的防御應(yīng)激反應(yīng)。
　　二、日本血吸蟲熱休克因子基因結(jié)構(gòu)特征及其可變剪切亞型分析研究<

9、br>　　目的：
　　熱休克因子作為經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合熱休克蛋白上游的熱休克原件進(jìn)而調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)。但是日本血吸蟲的熱休克因子沒有報(bào)道，本章首次進(jìn)行日本血吸蟲熱休克因子的克隆，鑒定，并分析其基因結(jié)構(gòu)特征和可變剪切亞型。為研究熱休克因子及其調(diào)控提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、日本血吸蟲尾蚴感染新西蘭白兔，42dpi灌注法收集雌蟲、雄蟲及感染兔肝臟，Trizol法提取總RNA;
　　2、自日本血吸蟲雌蟲、雄蟲、蟲

10、卵總RNA RT-PCR擴(kuò)增以獲得Sj-hsf ORF全長片段和Sj-hsf可變剪切區(qū)域片段，進(jìn)行克隆、酶切及測(cè)序鑒定;
　　3、用DNAMAN8.0、InterPro、Mega6結(jié)合日本血吸蟲和曼氏血吸蟲基因組數(shù)據(jù)庫以及GenBank等網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái)，深入分析Sj-hsf的基因結(jié)構(gòu)特征、可變剪切模式，與不同物種HSF序列的同源性、功能結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹
　　結(jié)果：
　　1、自雌蟲、雄蟲、蟲卵擴(kuò)增、克隆獲得陽性重組質(zhì)粒，其中

11、含Sj-hsf ORF的pBSjHSFf-F、pBSjHSFf-M、pBSjHSFf-E以及含可變剪切片段的pBSjHSFs-F、pBSjHSFs-M、pBSjHSFs-E，酶切及測(cè)序鑒定正確;
　　2、序列分析呈示Sj-hsf具有三種剪切亞型Sj-hsf-isoform1(2050bp)、Sj-hsf-isoform2(2086bp)、Sj-hsf-isoform3(2111 bp)，GenBank登陸號(hào)分別為KU954546、

12、KX119143、KX119144，均位于日本血吸蟲基因組SJC-S000780，有8個(gè)外顯子，在雌蟲、雄蟲和蟲卵階段三種亞型均存在，以Sj-hsf-isoform1表達(dá)量高;
　　3、Sj-HSF-isoform1(671 aa)、Sj-HSF-isoform2(683aa)具有HSF特征性DBD(DNABinding Domain)、HR-A/B和HR-C結(jié)構(gòu)域，Sj-HSF-isoform3(282aa)提前終止，無HR-C