TLR4信號通路與日本血吸蟲感染所致肝纖維化的關系及其機制初步研究.pdf

1、研究背景與目的：肝纖維化(hepatic fibrosis)繼發(fā)于多種慢性肝病,是肝損傷后的組織自我修復過程中的代償性反應，其實質是肝臟慢性炎癥過程中肝內膠原纖維的生成與降解失衡，致使膠原沉積過多而引起的病理過程，是多種慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化（hepatic cirrhosis）的必經(jīng)階段。已有研究發(fā)現(xiàn)炎癥和氧化應激損傷是肝纖維化發(fā)生的直接因素。Toll樣受體（TLRs)作為一種模式識別受體在抗感染以及炎癥反應中起重要作用。已有研究發(fā)

2、現(xiàn)TLR4在酒精性肝纖維化、病毒性肝纖維化以及原發(fā)性膽汁性肝纖維化中起重要作用，但還沒有研究報道TLR4在日本血吸蟲感染所致的肝纖維化中的作用，其機制也不明確。本文旨在研究TLR4在日本血吸蟲感染所致肝纖維化中的作用，并初步探討其機制。
　　研究方法：
　　1.實驗動物和日本血吸蟲感染所致肝纖維化動物模型的建立
　?。?）健康SPF級雌性6-8周齡BALB/c小鼠50只，隨機分為未感染正常對照組和實驗組。其中，隨機選取

3、40只小鼠作為實驗組，取20±3條日本血吸蟲尾蚴采用腹部皮膚貼片法感染小鼠，分別于感染后第5、6、8和12周各剖殺10只。剩余10只小鼠作為正常對照組，同實驗組于第8周同時間剖殺。
　?。?）健康SPF級雌性6-8周齡BALB/c小鼠40只，隨機分為無感染無用藥正常對照組（n=10）和實驗組（n=30）。實驗組隨機選取20只，取20±3條日本血吸蟲尾蚴采用腹部皮膚貼片法感染小鼠后隨機分為兩組（每組10只小鼠），其中一組小鼠于感染4

4、w后經(jīng)腹部注射TLR4抑制劑瑞沙托維TAK-242(Resatorvid，簡稱TAK)，2次/周，0.3mg/kg體重，持續(xù)到第8周；同時設立未感染TAK治療組（n=10）。以上各組均于第8周剖殺。
　　2.動物標本的處理：收集正常對照組和各實驗組小鼠的肝臟組織，分別用于總RNA提取、蛋白的提取以及石蠟切片的制備。
　　3.實驗方法
　　（1）Masson染色法檢測肝纖維化程度：Masson染色法用于觀察和檢測日本血吸

5、蟲感染后小鼠肝臟的病理改變及纖維化程度，其原理是利用陰離子染料分子大小和組織不同的滲透性來完成染色的。一般說來，結構稀疏，滲透性高的組織多選擇大分子染料，而結構致密，滲透性低的組織多選擇小分子染料。所以，膠原纖維被大分子的陰離子染料著染，肌纖維和胞質被中等大小的陰離子染料著染，而紅細胞則被最小分子的陰離子染料所著染。染色的結果是：膠原纖維成藍色（用苯胺藍復染）或綠色（用亮綠復染），胞質、肌纖維和紅細胞紅色，胞核藍褐色。
　?。?）

6、轉錄水平檢測:采用熒光定量PCR檢測日本血吸蟲感染后第5、6、8和12周和應用TLR4抑制劑 TAK治療前后小鼠肝臟組織內肝纖維化的指標包括α-SMA、Ⅰ型膠原（CollangenⅠ,colα-1）和Ⅲ型膠原（CollagenⅢ,colα-3）的RNA表達水平，肝纖維化過程中TLR4信號轉導通路中的TLR4，接頭蛋白MyD88、TRIF和炎癥性細胞因子 TNF-α、pro-IL-1β以及IP-10、RANTES的轉錄水平,炎癥小體內的識

7、別受體NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM-2和pro-Caspase-1的mRNA表達水平。
　?。?）蛋白表達水平檢測：采用免疫組織化學染色法檢測日本血吸蟲感染后第5、6、8和12周和應用TLR4抑制劑TAK治療后的小鼠肝臟組織內α–SMA的蛋白表達水平，以及肝纖維化過程中TLR4信號轉導過程中TLR4、p-IRF-3、p-IRAK4、活化的Casepase-1以及IL-1β的蛋白表達水平。
　　研究結果：

8、　　（1）小鼠肝臟的膠原面積在日本血吸蟲感染后的第5、6、8、12周逐漸增大，I型、III型膠原的轉錄水平以及肝星狀細胞活化的標志分子α-SMA的表達水平逐漸升高，第8周最嚴重；相較于第8周，第12周膠原面積變小，I型和III型膠原轉錄表達水平也降低，同時α-SMA轉錄和蛋白表達水平均降低。
　?。?）相較于未感染組，感染后5、6、8和12周小鼠肝組織內天然免疫模式識別受體TLR4，接頭分子MyD88、TRIF以及炎癥性細胞因子T

9、NF-α、IL-1β以及IP-10、RANTES轉錄水平均增加，TLR4，p-IRAK4、p-IRF3主要表達在肝臟門脈系統(tǒng)周圍細胞及蟲卵肉芽腫&纖維組織附近的肝細胞、肝星狀細胞和浸潤的炎性細胞內。
　?。?）TLR4抑制劑 TAK處理后，小鼠肝臟膠原面積在日本血吸蟲感染后的第8周顯著減少，α-SMA、I型和III型膠原的陽性表達降低。
　?。?）TLR4抑制劑TAK處理后，肝臟TNF-α、pro-IL-1β和IP-10、R

10、ANTES轉錄表達水平下降，肝臟p-IRAK4、p-IRF3蛋白表達水平下降。
　?。?）日本血吸蟲感染后5、6、8、12周小鼠肝臟炎癥小體內的受體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM-2以及pro-Caspase-1、pro-IL-1β mRNA水平增多，同時活性Caspase-1（p10）和IL-1β（p17）蛋白表達水平也升高；TLR4抑制劑TAK治療后，肝臟NLRP1、NLRC4、AIM-2、pro-Caspas

11、e-1和pro-IL-1β的轉錄水平下降；肝臟內活性Caspase-1(p10)和IL-1β(p17)的表達水平也下調。
　　結論：
　?。?）小鼠肝臟于日本血吸蟲感染后的第5周出現(xiàn)少量的纖維化，隨后纖維化逐漸加重，到第8周時纖維化最嚴重，感染后的第12周進入慢性肝纖維化期，肝纖維化程度與TLR4-MyD88依賴的信號通路和MyD88非依賴（TRIF依賴）信號通路的活化呈正相關。
　?。?）日本血吸蟲感染所致肝纖維化過