蚯蚓與日本血吸蟲免疫交叉反應(yīng)分子機制的研究.pdf

1、目的 免疫學(xué)檢測方法的準(zhǔn)確性主要取決于診斷抗原的性質(zhì)，目前用于日本血吸蟲病血清免疫學(xué)診斷的抗原主要為日本血吸蟲(Schistosomajaponicum，Sj)成蟲或蟲卵的粗抗原，由于抗原組分復(fù)雜，與臨床常見寄生蠕蟲間交叉反應(yīng)多，嚴(yán)重影響診斷的準(zhǔn)確性[1-8]。 為了解決這一交叉反應(yīng)難題，不少學(xué)者主要致力于尋找敏感性和特異性兼?zhèn)涞脑\斷抗原分子，而對交叉反應(yīng)的機理研究相對甚少。1995年Wisnewski[9]報道：陸生蚯

2、蚓(Lumbricusterrestris，Lt)抗原能與血吸蟲病患者血清結(jié)合，而不與正常人血清反應(yīng)；競爭性ELISA抑制水平可達(dá)30％以上；用Lt抗原免疫感染血吸蟲的小鼠可獲得36％減蟲率，產(chǎn)生的抗體能與多種血吸蟲成蟲抗原結(jié)合。這一研究結(jié)果，為尋找常見寄生蠕蟲間交叉反應(yīng)的同源性抗原分子提供了一條新思路。 本課題組多年來在對蚯蚓與血吸蟲、肺吸蟲、囊蟲和旋毛蟲等常見寄生蠕蟲間交叉反應(yīng)現(xiàn)象的研究[10-13]中發(fā)現(xiàn)：蚯蚓抗原能降低血

3、吸蟲病、肺吸蟲病、囊蟲病、旋毛蟲病等蠕蟲病患者血清抗體相互之間的交叉反應(yīng)率；目前還沒有某種蠕蟲抗原能象蚯蚓抗原一樣，同時識別血吸蟲病、肺吸蟲病、旋毛蟲病和囊蟲病患者血清，而不與正常人血清發(fā)生反應(yīng)。 鑒此，蚯蚓作為一種特殊抗原在血吸蟲病診斷研究中有著潛在的應(yīng)用價值。 本實驗采用噬菌體展示技術(shù)(phagedisplaytechnique，PDT)篩選獲得蚯蚓與日本血吸蟲的共同模擬表位；通過飽和硫酸銨溶液梯度鹽析法提取蚯蚓可溶

4、性蛋白；利用SDS-PAGE和Western-blot技術(shù)，對蚯蚓與日本血吸蟲共同模擬表位、蚯蚓的梯度鹽析蛋白、蚓激酶(lumbrukinase)和應(yīng)激蛋白(Stressproteins，SP)等分子成分及交叉反應(yīng)性進行分析，探討蚯蚓與日本血吸蟲間交叉反應(yīng)的重要分子基礎(chǔ)，為研究和解決臨床常見蠕蟲病血清免疫學(xué)診斷中交叉反應(yīng)現(xiàn)象提供理論和實驗依據(jù)。 方法 1.蚯蚓與日本血吸蟲共同模擬表位的篩選及交叉反應(yīng)性分析 (1)

5、蚯蚓與日本血吸蟲共同模擬表位的篩選 依次以日本血吸蟲病患者血清(Sj-Ig)、蚯蚓免疫兔血清(Lt-Ig)和Lt-Ig、Sj-Ig作為靶分子，以噬菌體12肽庫的第三輪擴增肽庫為源肽庫，進行2輪吸附-洗脫-擴增的免疫篩選，每輪隨機挑取藍(lán)色噬斑各21個，ELISA方法檢測其抗原性，并對其反應(yīng)性較好的陽性克隆進行測序。 (2)共同模擬表位交叉反應(yīng)性的分析 采用SDS-PAGE和Western-blot方法，制備12％分

6、離膠和6％濃縮膠，對經(jīng)篩選所獲的蚯蚓與日本血吸蟲共同模擬表位進行SDS-PAGE電泳，分析蛋白組分。電泳分離后轉(zhuǎn)至NC膜，并與日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)，分析蛋白組分的交叉反應(yīng)性。 2.蚯蚓梯度鹽析蛋白的制備及交叉反應(yīng)性分析 (1)蚯蚓梯度鹽析蛋白的制備參考飽和硫酸銨溶液鹽析提取蚯蚓蚓激酶的方法[14-17]，依次用30％、40％、50％、60％、70％飽和硫酸銨溶液梯度鹽析，沉淀蚯蚓可溶性蛋白。 (2)鹽析蛋白交

7、叉反應(yīng)性的分析 采用SDS-PAGE和Western-blot，制備12％分離膠和6％濃縮膠，對蚯蚓的鹽析蛋白進行SDS-PAGE電泳，分析蛋白組分。電泳分離后轉(zhuǎn)至NC膜，并與日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)，分析蛋白組分的交叉反應(yīng)性。 3.蚯蚓蚓激酶交叉反應(yīng)性的分析 采用SDS-PAGE和Western-blot，具體操作同蚯蚓梯度鹽析蛋白交叉反應(yīng)性的分析。 4.蚯蚓應(yīng)激蛋白的制備及交叉反應(yīng)性分析 (1

8、)蚯蚓應(yīng)激蛋白的制備參考加熱刺激產(chǎn)生應(yīng)激蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)[18-21]，取蚯蚓10條，40℃加熱30min，收集蚯蚓分泌物，即蚯蚓應(yīng)激蛋白。 (2)應(yīng)激蛋白交叉反應(yīng)性的分析 采用SDS-PAGE和Western-blot，具體操作同蚯蚓梯度鹽析蛋白交叉反應(yīng)性的分析。 結(jié)果 1.蚯蚓與日本血吸蟲共同模擬表位的篩選及交叉反應(yīng)性分析 (1)共同模擬表位的篩選 經(jīng)過2輪的吸附-洗脫-擴增，獲得了6個

9、A491nm值較高的克隆(Lt9、Lt14、Sj17、Sj18、SjLt6、SjLt11)，通過DNA測序，經(jīng)BLAST軟件分析，發(fā)現(xiàn)：Lt9與血吸蟲的抱雌溝蛋白和蚯蚓的NADH脫氫酶亞單位1有4個連續(xù)的氨基酸(LAET)一致；Sj17與血吸蟲的1-α延長因子和蚯蚓的1-α延長因子有4個不連續(xù)氨基酸(HT-HI)一致；SjLt11與血吸蟲的乳酸脫氫酶樣蛋白和蚯蚓的NADH脫氫酶亞單位6有4個連續(xù)的氨基酸(NSIL)一致。 (2)

10、3個共同模擬表位交叉反應(yīng)性的分析 將Lt9、Sj17、SjLt11這3個共同模擬表位同日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)，得到分子量為64.9kDa的交叉反應(yīng)帶。 2.蚯蚓梯度鹽析蛋白的SDS-PAGE和Western-blot結(jié)果 30％～70％飽和(NH4)2SO4溶液能沉淀較多的蚯蚓可溶性蛋白，對應(yīng)的分子量在25.3～112.7kDa和＜18.3kDa范圍內(nèi)，其中主帶分子量在25.3～54.7kDa和＜18.3kDa

11、；與日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)，對應(yīng)顯色帶的分子量在20.4～110.2kDa，其中主帶分子量為34.7、37.1～45.2、59.2、76.7～81.9、88.4～96.6kDa。 3.蚯蚓蚓激酶的SDS-PAGE和Western-blot結(jié)果 在SDS-PAGE膠上存在分子量為26.7～97.8kDa的蛋白帶，與日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)，對應(yīng)顯色帶的分子量在39.8～95.1kDa。 4.蚯蚓應(yīng)激蛋白的SDS-

12、PAGE和Western-blot結(jié)果 在SDS-PAGE膠上存在分子量為28.3～97.8kDa和＜19.6kDa的蛋白帶，與日本血吸蟲病患者血清反應(yīng)，對應(yīng)顯色帶的分子量在61.2～95.1kDa。 結(jié)論 1.用日本血吸蟲病患者血清和蚯蚓免疫兔血清篩選噬菌體12肽庫可獲得3個蚯蚓與日本血吸蟲共同模擬表位。 2.飽和硫酸銨溶液梯度鹽析法能有效地從蚯蚓可溶性物質(zhì)中提取到與日本血吸蟲間交叉反應(yīng)的蛋白抗原組分，

13、對應(yīng)的分子量在20.4～110.2kDa。 3.蚓激酶與日本血吸蟲間存在交叉反應(yīng)抗原，對應(yīng)的分子量在39.8～95.1kDa。 4.蚯蚓應(yīng)激蛋白與日本血吸蟲間也存在交叉反應(yīng)抗原，對應(yīng)的分子量在61.2～95.1kDa。 綜上所述，蚯蚓與日本血吸蟲共同模擬表位、蚯蚓的鹽析蛋白、蚓激酶和應(yīng)激蛋白與日本血吸蟲病患者血清間均存在分子量為61.2～95.1kDa的免疫交叉反應(yīng)帶，表明：蚯蚓與日本血吸蟲間存在分子量為61.2