MicroRNA-29b在日本血吸蟲鼠肝纖維化中表達及機制的初探.pdf

1、本文主要從以下三個部分展開論述：
　　第一章 MicroRNA-29b在日本血吸蟲小鼠肝纖維化組織中的表達變化
　　目的：
　　MicroRNA-29（miR-29）家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類與纖維化疾病密切相關的小分子RNA，其家族成員包括miR-29a、miR-29b、miR-29c。研究發(fā)現(xiàn)miR-29可通過直接抑制多種細胞外基質(zhì)蛋白表達和調(diào)控多種信號通路參與纖維化過程。但其在日本血吸蟲病肝纖維化中的作用尚未見報道，以

2、miR-29b為代表進行研究。建立日本血吸蟲肝纖維化小鼠模型，初步觀察miR-29b在肝臟組織中的表達情況，旨在探討miR-29b在日本血吸蟲肝纖維化中的作用機制。
　　方法：
　　Balb/cJ小鼠隨機分為感染組和未感染組(n=15只)，經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴（15±2）條/只，建立日本血吸蟲肝纖維化模型，未感染組不做任何處理。分別于感染第6w、8w、10w處死小鼠，取其肝組織，采用實時定量RT-PCR檢測4w、6w

3、、8w、10w、14w未感染組及感染組肝組織中miR-29 mRNA表達差異。
　　結果：
　　在血吸蟲病肝纖維化組織中，實時定量RT-PCR顯示miR-29b的表達呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化，在感染6w時下調(diào)最為顯著，而在第8w、10w逐漸上升，14w趨于穩(wěn)定，但仍低于未感染組，且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而不同時間點未感染組間miR-29b表達水平無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論：
　　在未感染組及感

4、染組肝組織中，miR-29b表達存在顯著差異。在感染組肝組織中miR-29b明顯下調(diào)，提示與血吸蟲肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程有關。研究其調(diào)控方式,可為進一步探索血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機制提供研究依據(jù)。
　　第二章 MicroRNA-29b過表達在NIH/3T3細胞的靶向作用
　　目的：
　　miR-29b己被證明在日本血吸蟲病肝纖維化組織中表達下調(diào)。多項研究亦表明，用生物信息學方法預測出COL1α1及COL3α1的3′非編碼

5、區(qū)與miR-29有互補序列，本實驗通過過表達miR-29b對COL1α1及COL3α1是否為miR-29b的直接靶點進行驗證。并將進一步對miR-29b是否通過調(diào)控膠原蛋白在血吸蟲病肝纖維化中發(fā)揮作用進行探討。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)NIH/3T3細胞，分為三組：miR-29b mimics組、miR-NC（miR-Negative Control）組及空白組。將miR-29b mimics及miR-NC與轉染試劑lipo

6、2000共轉染NIH/3T3細胞48小時后，采用RT-PCR驗證是否轉入細胞內(nèi)并檢測COL1α1及COL3α1mRNA表達水平；采用Western Blot和免疫熒光技術檢測細胞內(nèi)COL1及COL3蛋白質(zhì)表達變化。
　　結果：
　　RT-PCR結果顯示，miR-29b mimics組與MiR-NC組和空白組比較，miR-29b表達上調(diào),同時COL1α1及COL3α1mRNA及蛋白表達出現(xiàn)下調(diào)，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)<

7、br>　　結論：
　　證實COL1α1及COL3α1是miR-29b的直接靶向調(diào)控分子，miR-29b通過抑制COL1α1及COL3α1mRNA及蛋白表達在纖維化疾病的發(fā)病中發(fā)揮作用。
　　第三章 過表達MiR-29b影響TGF-β1致NIH/3T3細胞功能變化
　　目的：
　　COL1α1及COL3α1是miR-29b的直接靶向調(diào)控分子，miR-29b通過抑制COL1α1及COL3α1mRNA及蛋白的表達,在纖

8、維化疾病的發(fā)病中發(fā)揮作用。TGF-β1是目前已知的最重要的致肝纖維化細胞因子。既可促進細胞外基質(zhì)的合成，又可抑制其降解，在HSC激活過程中起重要作用。進一步研究miR-29b能否抑制TGF-β1所致NIH/3T3細胞功能變化如細胞增殖活力與凋亡及纖維化指標，對于探討血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機制具有重要的意義。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)細胞，分為TGF-β1+miR-29b mimics組、TGF-β1+MiR-NC組、TGF-β

9、1組和空白對照組。TGF-β1+miR-29b mimics組和TGF-β1+MiR-NC組為細胞水平轉染miR-29b mimics或MiR-NC100nm4～6h后，再加入10ng/ml TGF-β1，TGF-β1組為僅加入10ng/ml TGF-β1，空白對照組不做任何處理，于48h后收集細胞，采用RT-PCR及Western Blot檢測細胞中各纖維化指標mRNA及蛋白水平變化情況，同時運用流式細胞術檢測細胞的凋亡情況，CCK-

10、8檢測細胞活力變化。
　　結果：
　　1.常規(guī)培養(yǎng)NIH/3T3細胞可表達miR-29b，不同濃度TGF-β1（0、1、2.5、5、10ng/ml）干預24h后miR-29b呈逐漸下降趨勢，10ng/ml TGF-β1干預NIH/3T3細胞24h時miR-29b表達最低。然后以10ng/ml TGF-β1在不同時間（6h、12h、24h、48h、72h）干預NIH/3T3細胞，miR-29b亦呈逐漸下降的趨勢，以72h表達最

11、低。
　　2.轉染miR-29b mimics100nm48h，miR-29b表達明顯上調(diào)，與其他三組比較有顯著性差異。
　　3.轉染miR-29b mimics48h后，NIH/3T3細胞膠原合成和分泌明顯減少，其他纖維化指標如TIMP-1、HSP47、α-SMA mRNA及蛋白均明顯下降，MMP-9 mRNA及蛋白均明顯升高，與NC組及TGF-β1組及空白組比較均有統(tǒng)計學差異。
　　4.轉染48h后，流式細胞術檢測

12、結果顯示miR-29b mimics組早期凋亡明顯增多，而TGF-β1組及TGF-β1+NC組細胞凋亡下調(diào)，與空白組比較有統(tǒng)計學差異。
　　5.轉染48h后，miR-29b mimics組細胞活力明顯下降，而 TGF-β1組及TGF-β1+MiR-NC組細胞活力明顯上調(diào)，與空白組比較有統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　初步證實miR-29b mimics體外上調(diào)miR-29b表達有效；miR-29b表達上調(diào)可抑制TGF-β