熱休克蛋白47在大鼠結(jié)膜濾過泡瘢痕化過程中的作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、青光眼濾過術(shù)后濾過泡瘢痕化一直是眼科研究的熱點和難點。雖然對其進(jìn)行了大量的研究,但僅有絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)應(yīng)用于臨床,然而由于這兩種藥物的嚴(yán)重并發(fā)癥而使其臨床應(yīng)用受到限制。膠原蛋白的異常合成與沉積是纖維化疾病的病理基礎(chǔ),亦是瘢痕形成的重要原因。熱休克蛋白47(heat shock protein,HSP47)是一種相對分子質(zhì)量為47000的熱休克蛋白,存在于

2、膠原蛋白分泌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,與前膠原特異性結(jié)合,參與前膠原的折疊、裝配、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程,被認(rèn)為是膠原特異性分子伴侶,為膠原合成所必需。多種纖維化疾病模型和人類纖維化疾病的研究均證實,HSP47的表達(dá)上調(diào)與膠原合成增加以及纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。抑制HSP47的表達(dá)可以抑制膠原合成,減弱纖維化程度。因此我們假設(shè)HSP47有可能成為治療纖維化疾病的有效靶點。
　　 目的:
　　 探討HSP47在大鼠濾過術(shù)后濾過泡瘢痕化

3、過程中的作用及其作用機(jī)制,以及通過此途徑可能減輕濾過泡瘢痕化的方法。
　　 方法:
　　 1.建立濾過術(shù)后結(jié)膜濾過泡瘢痕化大鼠模型。
　　 2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法,了解HSP47在大鼠濾過術(shù)后濾過泡中的表達(dá)情況。
　　 3.應(yīng)用天狼星紅-苦味酸染色方法,了解Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術(shù)后濾過泡中的表達(dá)情況。
　　 4.應(yīng)用實時熒光定量PCR和Westernblot方法,分別檢測HSP47、

4、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術(shù)后不同時間點濾過泡中基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平表達(dá)變化的情況。
　　 5.采用抗HSP47單克隆抗體結(jié)膜下注射的方法,檢測抑制HSP47蛋白的表達(dá)情況,應(yīng)用實時熒光定量。PCR和Western blot方法,分別檢測Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.選用大鼠作為實驗動物,于濾過術(shù)中切除全層角鞏膜緣組織,成功建立了濾過術(shù)后結(jié)膜濾過泡瘢痕化動物模型。
　　 2

5、.HSP47在大鼠濾過術(shù)后濾過泡和正常結(jié)膜組織均有表達(dá)。表達(dá)染色的細(xì)胞絕大多數(shù)為梭型的成纖維細(xì)胞,少數(shù)為血管內(nèi)皮細(xì)胞,定位于細(xì)胞漿。濾過術(shù)后1w,HSP47蛋白較正常結(jié)膜組織明顯增多；濾過術(shù)后2w,HSP47蛋白較術(shù)后1w有所減少,但是仍然比正常結(jié)膜組織表達(dá)水平高。
　　 3.應(yīng)用天狼星紅.苦味酸染色方法可以清晰地顯示Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術(shù)后濾過泡的表達(dá)情況。濾過術(shù)后1w,大鼠濾過泡膠原蛋白較正常結(jié)膜組織增多,以Ⅲ型膠原

6、增加為主；濾過術(shù)后2w,大鼠濾過泡膠原蛋白較術(shù)后1w明顯增加,以Ⅰ型膠原增加為主。
　　 4.大鼠濾過術(shù)后濾過泡中HSP47和Ⅲ型膠原在mRNA水平與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均在術(shù)后2d就有增加,術(shù)后5d、8d、11d時明顯增加,與正常對照組相比均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),術(shù)后8d均達(dá)到峰值,術(shù)后11d均下降,但仍高于術(shù)后5d的表達(dá)水平。在濾過術(shù)后2d、5d時,Ⅰ型膠原在mRNA水平與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)增加,術(shù)后8d、11d時明

7、顯增加,與正常對照組相比有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 5.抗HSP47單克隆抗體結(jié)膜下注射1ug后,在蛋白質(zhì)水平抑制了HSP47的表達(dá),Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在mRNA水平與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均下降,與生理鹽水組相比差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與MMC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HSP47在大鼠濾過術(shù)后濾過泡成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)較正常結(jié)膜組織明顯

8、增高。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術(shù)后濾過泡的表達(dá)較正常結(jié)膜組織明顯增高。手術(shù)創(chuàng)傷可以促使HSP47、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào),表明HSP47、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過泡瘢痕化過程中可能會發(fā)揮重要作用。
　　 2.抑制濾過術(shù)后濾過泡中HSP47的表達(dá),可以減少Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在濾過泡的沉積,從而減輕濾過泡的瘢痕化反應(yīng)。表明HSP47在大鼠濾過泡瘢痕化過程中通過調(diào)控Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)而發(fā)揮作用?？?/p>