老年性聾小鼠Math1基因?qū)胝T導(dǎo)耳蝸毛細胞再生的研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界約有2.5億人患有重度以上聽力損失，其中2/3在發(fā)展中國家，我國是最大的發(fā)展中國家，聽力障礙殘疾人有2780萬，60歲及以上為1540.5萬，可以說老年性聽力損失患者是我國最大的聽力障礙群體。由于相當(dāng)一部分老年性聾是由于毛細胞缺失引起，所以說毛細胞再生對于老年性聾的治療有重要意義。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)Math1基因?qū)τ诙伆l(fā)育過程中毛細胞的形成有決定性作用，進一步研究表明Math1有可能引起成熟哺乳動

2、物毛細胞再生，但未見其能否在老年性聾動物模型中誘導(dǎo)毛細胞再生的報導(dǎo).本研究擬行C57BL/6小鼠老年性聾動物模型評價；小鼠耳蝸外源基因?qū)胪緩郊胺椒ǖ难芯?；老年性聾C57BL/6小鼠內(nèi)耳Math1基因?qū)牒竺毎麡蛹毎挠^察。
　　 第一部分 C57BL/6小鼠內(nèi)耳形態(tài)學(xué)和年齡相關(guān)性聽力損失的研究
　　 [方法]為研究不同周齡C57BL/6小鼠內(nèi)耳形態(tài)學(xué)及其ABR閾值變化。取C57BL/6小鼠3周、4周、12周、26周各

3、15只，聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試雙側(cè)2、4，8、16，20KHz ABR閾值測試。采用基底膜鋪片后免疫組化染MyosinVI、Neurofilament，觀察耳蝸毛細胞和神經(jīng)絲的變化。掃描電鏡觀察耳蝸毛細胞及其靜纖毛隨年齡變化。冰凍切片HE染色觀察corti'器毛細胞及支持細胞、血管紋、螺旋神經(jīng)元細胞隨年齡變化。
　　 [結(jié)果]隨著年齡增長，C57BL/6小鼠各頻率ABR閾值明顯提高；頂轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)內(nèi)毛細胞缺失逐漸增多；神經(jīng)絲染色

4、漸淡；毛細胞靜纖毛逐漸發(fā)生數(shù)量減少、增粗融合、倒伏等變化。到26周齡時已達到重度聾，各頻率較3周組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。頂轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)內(nèi)毛細胞有連續(xù)缺失，外毛細胞完全缺失，內(nèi)毛細胞只有殘存的少量靜纖毛，粗細不均，倒伏明顯。切片HE染色顯示corti'器毛細胞及支持細胞、血管紋、螺旋神經(jīng)元細胞隨年齡變化也發(fā)生了明顯的退行性變化。
　　 [結(jié)論]本研究對國產(chǎn)C57BL/6小鼠的內(nèi)耳形態(tài)學(xué)進行觀察，明確了其ABR閾值和內(nèi)耳毛細胞的變化規(guī)律。說

5、明當(dāng)國產(chǎn)C57BL/6小鼠年齡達到26周時，ABR2、4、8、16、20KHzABR閾值已達到95dB(SPL)以上，外毛細胞已經(jīng)完全缺失，可以用來作為毛細胞再生的模型，而不會受到殘存內(nèi)毛細胞的影響.血管紋、corti'器、螺旋神經(jīng)元細胞隨年齡變化也發(fā)生了明顯的退行性變化，這給我們的實驗提供了良好的老年性聾耳蝸微環(huán)境。也為國產(chǎn)C57BL/6小鼠老年性聾研究和活體毛細胞再生的動物模型提供了形態(tài)學(xué)理論依據(jù)，說明國產(chǎn)C57BL/6小鼠年齡達到

6、26周時可以應(yīng)用于老年性聾的毛細胞再生研究。
　　 第二部分 C57BL/6小鼠外源基因內(nèi)耳導(dǎo)入路徑與方式及內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的研究
　　 一 C57BL/6小鼠耳后入路各種導(dǎo)入方式
　　 為了研究腺病毒攜帶目的基因經(jīng)小鼠耳后入路各種導(dǎo)入方法的可行性，為以小鼠為動物模型的內(nèi)耳基因治療提供實驗基礎(chǔ)和解剖學(xué)依據(jù)。
　　 [方法]我們采用經(jīng)圓窗膜顯微注射腺病毒攜帶目的基因?qū)?、刺破圓窗膜-明膠海綿介導(dǎo)載體導(dǎo)入、用浸泡治療

7、介質(zhì)明膠粘貼圓窗膜的方法，將攜帶的增強型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒或人工外淋巴液導(dǎo)入C57BL/6J小鼠耳蝸。耳后入路磨開聽泡后上骨壁，暴露圓窗龕，經(jīng)圓窗膜顯微注射注入耳蝸內(nèi)。分別于術(shù)后7天ABR測聽后取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP表達，同時用掃描電鏡、MyosinVI染色觀察導(dǎo)入后耳蝸形態(tài)學(xué)變化。
　　 [結(jié)果]術(shù)后動物存活較好，經(jīng)圓窗膜顯微注射導(dǎo)入后聽力喪失，其余各組聽力保存較好。各組腺病毒導(dǎo)入

8、后，轉(zhuǎn)染耳蝸底轉(zhuǎn)基底膜及螺旋神經(jīng)節(jié)上目的基因有表達。對照組耳蝸未見熒光表達。但是用浸泡治療介質(zhì)明膠粘貼圓窗膜方法導(dǎo)入后，外源基因表達過于局限。圓窗膜顯微注射導(dǎo)入和刺破圓窗膜一明膠海綿介導(dǎo)載體導(dǎo)入后外源基因表達強烈，但是刺破圓窗膜-明膠海綿介導(dǎo)載體導(dǎo)入后外毛細胞受損嚴重。
　　 [結(jié)論］耳后入路操作簡單、損傷小、易于暴露圓窗龕.耳后入路圓窗膜顯微注射腺病毒攜帶目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法能夠?qū)⒛康幕虺晒D(zhuǎn)導(dǎo)至耳蝸組織并表達，同時可以滿足單

9、純的形態(tài)學(xué)研究。
　　 二腹側(cè)聽泡外入路小鼠耳蝸鼓階基因?qū)?br>　　 為研究腺病毒攜帶目的基因經(jīng)腹側(cè)聽泡外入路轉(zhuǎn)導(dǎo)耳蝸鼓階底轉(zhuǎn)的可行性及目的基因的表達特點，為內(nèi)耳基因治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 [方法]將3周齡C57BL/6小鼠，以重組腺病毒攜帶的增強型綠色熒光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein，EGFP)或人工外淋巴液經(jīng)腹側(cè)聽泡外入路導(dǎo)入耳蝸鼓階底轉(zhuǎn).分別于術(shù)后

10、第7天分別行聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢查后取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片、耳蝸冰凍切片觀察基因的表達。同時用掃描電鏡和鋪片MyosinVI染色以觀察毛細胞纖毛和胞體受損情況。
　　 [結(jié)果]經(jīng)腹側(cè)聽泡外入路轉(zhuǎn)導(dǎo)耳蝸鼓階底轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對聽力及毛細胞影響較小。腺病毒組耳蝸內(nèi)目的基因呈廣泛表達.對照組耳蝸未見熒光表達。
　　 [結(jié)論]經(jīng)腹側(cè)聽泡外入路轉(zhuǎn)導(dǎo)耳蝸鼓階底轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法可以有效保護聽力及毛細胞，且能夠?qū)⒛康幕虺晒D(zhuǎn)導(dǎo)至耳蝸組

11、織并廣泛表達。
　　 第三部分老年性聾模型小鼠C57BL/6耳蝸鼓階外源基因Math1導(dǎo)入后出現(xiàn)毛細胞樣細胞現(xiàn)象的觀察
　　 為了觀察老年性聾C57BL/6小鼠(8月齡)耳蝸鼓階外源基因Math1導(dǎo)入后能否在老年性聾的耳蝸微環(huán)境誘導(dǎo)出新生的毛細胞樣細胞，為Math1基因治療老年性聾進行探索性研究。
　　 [方法]將8月齡C57BL/6小鼠，以攜帶Math1基因的重組腺病毒(實驗組)或只攜帶GFP基因的重組腺病毒(

12、對照組)經(jīng)腹側(cè)聽泡外入路導(dǎo)入耳蝸鼓階底轉(zhuǎn)。分別于術(shù)后第3.5個月分別行聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢查后取雙側(cè)耳蝸標(biāo)本做基底膜鋪片和耳蝸冰凍切片MyosinVI染色觀察有無新生毛細胞樣細胞出現(xiàn)，部分耳蝸作掃描電鏡觀察。
　　 [結(jié)果]實驗組和對照組最大刺激均無ABR波形引出，掃描電鏡也未能觀察到纖毛結(jié)構(gòu)。但是在Math1基因?qū)牒?，外毛細胞區(qū)域有MyosinVI染色陽性的新生毛細胞樣細胞，部分動物Math1基因?qū)牒蠖亙?nèi)有核分裂現(xiàn)象