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1、目的:體外研究表明在大鼠橢圓囊上皮內(nèi)過(guò)量表達(dá)基因Atoh1/Math1可以誘導(dǎo)產(chǎn)生新的毛細(xì)胞,但相關(guān)在體動(dòng)物研究尚無(wú)明確結(jié)論。本研究利用轉(zhuǎn)基因小鼠建立了可在特定時(shí)點(diǎn)于前庭上皮內(nèi)過(guò)量表達(dá)基因Atoh1/Math1的動(dòng)物模型,擬應(yīng)用該動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究以回答如下問(wèn)題:1.過(guò)量表達(dá)基因Atoh1/Math1能否在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)產(chǎn)生新的前庭毛細(xì)胞;2.在前庭上皮內(nèi)什么類(lèi)型的細(xì)胞具有在基因Atoh1/Math1誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞的能力;3.這種
2、可轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞的能力是否隨著組織發(fā)育的不斷成熟而逐漸消失;4.除了促進(jìn)細(xì)胞分化以外,Atoh1/Math1的過(guò)量表達(dá)是否具有促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的作用;5.能否通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的毛細(xì)胞。
方法:本研究使用了在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下能夠定時(shí)定位表達(dá)外源性Atoh1/Math1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。在該型小鼠體內(nèi),F(xiàn)oxg1基因使Cre重組酶特異性的表達(dá)于小鼠內(nèi)耳上皮;在該組織內(nèi),Cre重組酶能切除rtTA基因上游的終止框
3、,使rtTA基因表達(dá)。若同時(shí)在特定的時(shí)點(diǎn)用含有強(qiáng)力霉素的食物飼喂小鼠,則rtTA和強(qiáng)力霉素結(jié)合共同作用于外源性Atoh1/Math1基因上游的TRE,啟動(dòng)Atoh1/Math1基因的表達(dá)。本研究首先通過(guò)在小鼠生后不同的時(shí)點(diǎn)用含有強(qiáng)力霉素的食物和飲水飼喂小鼠,誘導(dǎo)其體內(nèi)的Atoh1/Math1基因表達(dá),觀察過(guò)量表達(dá)Atoh1/Math1基因在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)小鼠橢圓囊感覺(jué)上皮發(fā)育的影響,判定是否有新的毛細(xì)胞產(chǎn)生。然后,本研究在用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)At
4、oh1/Math1大量表達(dá)的同時(shí),對(duì)小鼠皮下注射Brdu,通過(guò)對(duì)Brdu進(jìn)行染色,觀察在Atoh1/Math1介導(dǎo)的在體前庭毛細(xì)胞再生過(guò)程中有無(wú)細(xì)胞分裂和增殖現(xiàn)象。最后,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)技術(shù),通過(guò)藥物抑制Notch、FGF和BMP等信號(hào)通路,研究了抑制這些信號(hào)通路對(duì)毛細(xì)胞再生效應(yīng)的有關(guān)作用。
結(jié)果:逆轉(zhuǎn)錄半定量PCR表明,在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下,基因型為pTM+,foxglcre+,rtTA+的陽(yáng)性小鼠橢圓囊上皮Atoh1/M
5、ath1基因的mRNA水平要顯著高于基因型為pTM-,foxglcre+,rtTA+的陰性對(duì)照小鼠。在本實(shí)驗(yàn)所涉及的最后時(shí)點(diǎn)生后第21天,利用Atoh1/Math1-GFP基因作為報(bào)告基因,本研究發(fā)現(xiàn)在基因型為pTM+,foxglere+,rtTA+的陽(yáng)性小鼠橢圓囊上皮內(nèi),GFP信號(hào)不僅存在于毛細(xì)胞層,而且大量表達(dá)于支持細(xì)胞層。而在基因型為pTM-,foxglcre+,rtTA+的陰性小鼠橢圓囊上皮中,GFP僅較多的存在于毛細(xì)胞層,在支
6、持細(xì)胞層只有個(gè)別細(xì)胞表達(dá)GFP。該結(jié)果表明在出生后第21天,仍可在陽(yáng)性動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)Atoh1/Math1基因在蛋白水平的過(guò)量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究了P0,P7,P14和P21四個(gè)時(shí)點(diǎn)在小鼠體內(nèi)過(guò)量表達(dá)Atoh1/Math1對(duì)小鼠橢圓囊感覺(jué)上皮發(fā)育造成的影響,結(jié)果表明在新生小鼠的橢圓囊上皮內(nèi)過(guò)量表達(dá)Atoh1/Math1可在微紋區(qū)及其附近和非感覺(jué)區(qū)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的毛細(xì)胞,隨著生后天數(shù)的不斷延長(zhǎng),產(chǎn)生的新生毛細(xì)胞逐漸減少。在P7階段已無(wú)法在非感覺(jué)區(qū)誘
7、導(dǎo)產(chǎn)生新的毛細(xì)胞,在P21階段,則無(wú)法在微紋區(qū)及其附近誘導(dǎo)產(chǎn)生新的毛細(xì)胞。通過(guò)對(duì)小鼠皮下注射Brdu并行染色,本研究對(duì)Atoh1/Math1介導(dǎo)的前庭毛細(xì)胞在體再生過(guò)程中的分裂增殖變化進(jìn)行了分析,結(jié)果表明在過(guò)量表達(dá)Atoh1/Math1的情況下,新生小鼠橢圓囊感覺(jué)上皮存在著活躍的有絲分裂活動(dòng),并且部分新生毛細(xì)胞為Brdu染色陽(yáng)性;細(xì)胞分裂增殖現(xiàn)象存在于整個(gè)橢圓囊上皮,尤以微紋區(qū)及其附近最為顯著。最后,在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)藥物
8、抑制Notch和FGF信號(hào)通路能夠增加橢圓囊感覺(jué)上皮內(nèi)表達(dá)Atoh1/Math1的細(xì)胞數(shù)量,并在橢圓囊微紋區(qū)誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的毛細(xì)胞,而抑制BMP信號(hào)通路則無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的毛細(xì)胞。
結(jié)論:過(guò)量表達(dá)Atoh1/Math1基因可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的前庭毛細(xì)胞;在橢圓囊上皮內(nèi)位于微紋區(qū)及其附近的支持細(xì)胞和位于非感覺(jué)區(qū)的細(xì)胞具有在Atoh1/Math1作用下轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞的能力;這些轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞的能力隨著生后時(shí)間的不斷延長(zhǎng)逐漸消失
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