rAAV2-1介導(dǎo)的GH1基因的表達(dá)、檢測(cè)及生物安全性研究.pdf

1、第一部分:rAAV2/1介導(dǎo)的GH1基因體外轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞
　　 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)rAAV2/1-CMV-GH1病毒細(xì)胞株體外轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞有效性進(jìn)行研究,探討病毒以不同的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)和轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)rAAV2/1-CMV-GH1體外轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)MOI=1.0×105 v.g./孔,轉(zhuǎn)染48 h,rAAV2/1-CMV-GH1轉(zhuǎn)染效率最高,rAAV2/1

2、病毒介導(dǎo)的GH1體外轉(zhuǎn)染對(duì)感染復(fù)數(shù)、轉(zhuǎn)染時(shí)間具有依賴性。RT-PCR和Western blot分別從轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯水平驗(yàn)證了上述結(jié)果。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,GH1提高了BHK-21細(xì)胞增殖率,有效促進(jìn)了BHK-21細(xì)胞的增殖。
　　 第二部分:rAAV2/1介導(dǎo)的GH1基因轉(zhuǎn)染大鼠
　　 本研究發(fā)現(xiàn)外源GH1基因在健康大鼠體內(nèi)持續(xù)特異性表達(dá)雖然可以促進(jìn)局部肌肉肥大,卻沒有增強(qiáng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力。而注射rAAV2/1-CMV

3、-GH1會(huì)對(duì)健康大鼠肝臟、心臟和脂代謝產(chǎn)生一定影響。血清hGH、胰島素、血糖和瘦素水平上升顯著,從而有可能引起機(jī)體胰島素拮抗。大鼠血清IGF-1、IGF-BP3和PIIINP水平也顯著增加。由此可見,對(duì)健康大鼠肌注GH1基因不能增加肌肉力量且會(huì)引起機(jī)體一系列反應(yīng)。
　　 第三部分:rAAV2/1介導(dǎo)的GH1基因轉(zhuǎn)染大鼠前后基因表達(dá)差異譜的研究
　　 通過對(duì)接受GH基因治療的正常成年雄性SD大鼠外周血全基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),

4、治療組大鼠全血中有61個(gè)基因差異表達(dá)(ratio>2,p<0.05)。這些基因主要與血管新生、腫瘤發(fā)生、發(fā)展的凋亡、免疫網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)傳導(dǎo)通路、新陳代謝、1型糖尿病、碳固定、細(xì)胞粘附分子及細(xì)胞因子受體的相互作用有關(guān)。結(jié)果顯示外源性GH1基因在正常大鼠體內(nèi)表達(dá)有可能誘發(fā)細(xì)胞代謝、信號(hào)通路和機(jī)體免疫水平等的改變。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了芯片分析結(jié)果的可靠性。我們從差異表達(dá)的基因中篩選8個(gè)作為候選標(biāo)記物(ratio>5,P<0.05)。采用15份