RLI1介導(dǎo)的翻譯調(diào)控對釀酒酵母異源表達影響.pdf

1、酵母作為真核細胞工廠，無論在蛋白質(zhì)累積、生產(chǎn)還是在途徑整合、構(gòu)建的合成生物學(xué)研究中，都占據(jù)著非常重要的地位，其異源表達調(diào)控自然地成為了研究熱點。以提高酵母異源蛋白表達量為目標(biāo)，科研人員相繼在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平及翻譯后水平上的調(diào)控進行了大量研究，而近年才涉及到翻譯水平的調(diào)控研究。RLI1基因在核糖體生源及其再循環(huán)中起到重要作用，特別是在翻譯終止后RLI1能夠推動核糖體解聚再次進入翻譯循環(huán)。本文擬通過RLI1基因的表達從而調(diào)節(jié)相關(guān)環(huán)節(jié)的翻譯

2、過程，來加快核糖體的再循環(huán)，以期緩解異源表達過程mRNA豐度過高造成的自由核糖體限制問題。
　　首先，我們直接合成了銅離子誘導(dǎo)型的GFP及RFP表達盒DNA序列，構(gòu)建了基于 YEplac181質(zhì)粒的多拷貝的表達載體，轉(zhuǎn)化 W303宿主后得到了報告基因系統(tǒng)。熒光鏡檢結(jié)果表明，兩種報告基因系統(tǒng)均可在0~100μM Cu2+下啟動表達，但因培養(yǎng)體系中痕量Cu2+存在，在0μM Cu2+下報告基因仍可啟動表達，為了系統(tǒng)的有效性，最終選取了

3、50μM Cu2+作為誘導(dǎo)劑量；其次，通過生物信息數(shù)據(jù)庫獲得了GAL1啟動子，TEF終止子及RLI1編碼序列信息，在對其進行分析后，設(shè)計并合成了相關(guān)引物對，以釀酒酵母W303基因組為模板通過PCR擴增技術(shù)獲得了各序列，并利用序列兩端的限制性內(nèi)切酶位點與低拷貝數(shù)的 YCplac33載體連接，轉(zhuǎn)化 W303宿主后構(gòu)建了本研究的工程菌。在此基礎(chǔ)上，進一步通過測定酵母的生長曲線，dilution實驗，熒光顯微鏡觀察以及流式細胞儀檢測等技術(shù)手段研

4、究了RLI1的過表達對宿主細胞的影響。研究表明，與對照相比，RLI1可控上調(diào)表達菌株無論是一般液體培養(yǎng)模式還是在dilution分析中，均表現(xiàn)出明顯的菌體生長抑制現(xiàn)象；同時，耗糖實驗表明，不同實驗室流轉(zhuǎn)的 W303菌株之間至少在碳源利用方面存在較大差異，并且可以通過實驗室定向進化方法，在較短時間內(nèi)彌補這種差異，暗示甘油、半乳糖利用相關(guān)基因具有變異快特性；最后經(jīng)流式細胞術(shù)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，RLI1上調(diào)表達可顯著增加異源蛋白GFP在特定誘導(dǎo)區(qū)間內(nèi)的