磷酸化調控FUNDC1介導的線粒體自噬研究.pdf

1、線粒體在細胞能量代謝和細胞凋亡調控中都有很重要的作用。因此，保持線粒體適當?shù)臄?shù)量和質量對細胞正常生命活動至關重要。在進化過程中，細胞發(fā)展了復雜體系來監(jiān)控線粒體質量，能通過選擇性自噬機制有效清除過多的或受損的線粒體。線粒體自噬機制的異常與多種衰老相關疾病如代謝綜合征，神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等的發(fā)生密切相關。近年來，線粒體自噬受到越來越廣泛的研究，但其調控機制及其在疾病發(fā)生中的關鍵作用尚不完全明了。
　　我們實驗室發(fā)現(xiàn)了一個新的線粒體自

2、噬受體分子FUNDC1，它是一個定位于線粒體外膜上的三次跨膜蛋白，在其面向胞漿的N端具有典型的與自噬相關蛋白LC3(microtubule-associated protein Light Chain3)相互作用的模序YxxL(LC3-Interacting Region，LIR)。在低氧刺激下，F(xiàn)UNDC1通過LIR與LC3相互作用，募集自噬膜泡包裹線粒體從而介導線粒體自噬。但是，在正常情況下FUNDC1能穩(wěn)定存在于線粒體外膜而不介導

3、線粒體自噬的發(fā)生。因此推測，在蛋白水平調控之外，細胞存在其它精細的機制來抑制或者激活FUNDC1以調控其介導的線粒體自噬。本篇論文以FUNDC1介導的線粒體自噬為模型，著重研究線粒體自噬的分子調控機制。
　　本篇論文的研究表明FUNDC1可逆的磷酸化狀態(tài)在調控線粒體自噬方面起到了關鍵作用。在正常情況下，位于FUNDC1 LIR中的第18位酪氨酸(Tyr18)以及靠近LIR的第13位絲氨酸(Ser13)是被高度磷酸化的，而在低氧和F

4、CCP刺激下，這兩個位點則會顯著去磷酸化。進一步研究表明，磷酸化能直接調節(jié)FUNDC1與LC3的相互作用，進而調控線粒體自噬。正常情況下，磷酸化的FUNDC1與LC3相互作用較弱，抑制線粒體自噬，在相關刺激下，F(xiàn)UNDC1去磷酸化，增強兩者的相互作用，促進線粒體自噬。用非磷酸化的FUNDC1多肽處理細胞，能抑制內源的FUNDC1與LC3相互作用，進而抑制線粒體自噬;但是，相應的磷酸化的多肽只有很弱的效果。
　　為了深入理解去磷酸化

5、激活線粒體自噬的分子機制，本論文采用生化分析等方法鑒定出FUNDC1 Ser13的磷酸酶是PGAM5。在正常情況下PGAM5與FUNDC1相互作用很弱，但是在線粒體自噬信號下，兩者的相互作用顯著增強，促進Ser13去磷酸化。在HeLa細胞中敲低PGAM5表達水平抑制Ser13去磷酸化、FUNDC1與LC3相互作用及線粒體自噬，但是，在這些細胞中重新表達野生型的PGAM5能促使FUNDC1 Ser13去磷酸化以及線粒體自噬，而PGAM5磷

6、酸酶活性缺失突變體不具有這種效果。另外，過表達FUNDC1 Ser13磷酸化缺失突變(S13A)能克服PGAM5敲低造成的線粒體自噬受損，而野生型FUNDC1不具有這種能力。因此，在線粒體自噬信號刺激下，PGAM5促進Ser13去磷酸化，增強FUNDC1與LC3的相互作用，從而促進線粒體自噬。
　　為了探索FUNDC1磷酸化機制，本論文鑒定了FUNDC1的激酶。結果發(fā)現(xiàn)CK2是Ser13的激酶，而Src是Tyr18的激酶。這兩個激

7、酶能通過磷酸化各自的位點抑制FUNDC1與LC3的相互作用，進而抑制線粒體自噬，以保持線粒體數(shù)量穩(wěn)定。改變CK2以及Src的表達水平能改變細胞對線粒體自噬的響應。
　　進一步研究表明Ser13和Tyr18兩個位點的磷酸化可能協(xié)同調節(jié)FUNDC1介導的線粒體自噬。首先，線粒體自噬信號刺激會同時減弱CK2和Src與FUNDC1的相互作用，以促進Ser13和Tyr18同時去磷酸化。其次，用CK2以及Src的抑制劑分別處理細胞能造成各自的

8、磷酸化位點去磷酸化，但是檢測不到線粒體自噬;只有用兩種激酶的抑制劑同時處理細胞才能造成明顯的線粒體自噬。
　　綜上所述，本論文的研究表明，在正常情況下，F(xiàn)UNDC1被CK2以及Src磷酸化，抑制其與LC3的相互作用及線粒體自噬，以保證細胞有適當數(shù)量的線粒體。在線粒體自噬信號刺激下，激酶CK2及Src與FUNDC1的結合能力減弱，同時磷酸酶PGAM5與FUNDC1的相互作用增強，促進FUNDC1去磷酸化。去磷酸化的FUNDC1具有更