BRCA1對S期DNA--PKcs自磷酸化的調(diào)控作用研究.pdf

1、DNA雙鏈斷裂(Double strands-break，DSB)可由許多因素造成，包括內(nèi)源的因素如細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)、復(fù)制壓力以及V(D)J重組(V(D)J recombination)，以及外源的因素如電離輻射(IonizingRadiation，IR)和化療藥物等。未修復(fù)或錯誤修復(fù)的DSB會導(dǎo)致染色體變異，包括異位和缺失，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些染色體的畸變會造成

2、遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定性并可能最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。為了消除DSB產(chǎn)生的影響，真核細(xì)胞形成了兩種高效的DNA修復(fù)機(jī)制，即非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重組(homologous recombination，HR)。NHEJ可以將斷裂的DNA直接連接起來，而HR需要利用同源的DNA模板進(jìn)行復(fù)制。NHEJ通路主要由DNA-PK（DNA-dependent Protein kinase，DNA依

3、賴性蛋白激酶）來完成。首先由DNA-PK的亞單位Ku70/Ku80二聚體聚集到斷裂的DNA末端，接著Ku70/Ku80招募DNA-PKcs(DNA-PK catalytic subunit，DNA-PK催化亞單位)到DSB末端。DNA-PKcs和Ku70/Ku80可以在DNA末端形成獨特的結(jié)構(gòu)，這個聯(lián)合體結(jié)構(gòu)將斷裂的DNA末端緊緊的牽系在一起。在末端處理之后，斷裂的DNA末端被連接在一起。而HR首先由5'-3'末端剪切開始。末端剪切產(chǎn)生

4、的單鏈DNA(single strandDNA，ssDNA)利于鏈侵入反應(yīng)的發(fā)生和同源染色體的交換。隨后通過DNA合成、連接及支鏈遷移，同源中間體(Holliday連接體)被分解，斷裂的DNA雙鏈得到修復(fù)。雖然DNA雙鏈修復(fù)通路中的許多因素已經(jīng)被確定并對其功能做了研究，但是仍有很多重要問題沒有得到解答，比如哪些蛋白優(yōu)先結(jié)合到DNA雙鏈斷裂的末端并如何使其更加穩(wěn)定;此外，調(diào)節(jié)DSB修復(fù)通路選擇(NHEJ和HR)的機(jī)制也還未明確。
　

5、　NHEJ的發(fā)生沒有細(xì)胞周期限制，而HR只在S/G2期發(fā)生。DSB修復(fù)通路的細(xì)胞周期依賴性暗示著細(xì)胞周期在DSB修復(fù)通路NHEJ和HR的選擇中可能發(fā)揮作用。作為NHEJ核心成分的DNA-PKcs，其磷酸化對其功能的執(zhí)行是必需的。其中，在絲氨酸(Serine，S)2056簇的自磷酸化（autophosphorylation）尤其重要。在本研究中，首先利用活細(xì)胞成像激光微輻射系統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)在S期細(xì)胞中，NHEJ因子DNA-PKcs可以聚集到

6、DSB位點，且初始的聚集和動力學(xué)特征與其在非S期的細(xì)胞中相似，表明DNA-PKcs在任何細(xì)胞周期都可以被招募到DSB，提示S期NHEJ的降低不受二者結(jié)合的調(diào)控。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在S期DNA-PKcs S2056的自磷酸化減弱，并能抑制NHEJ的發(fā)生。因此，調(diào)控DNA-PKcs的S2506自磷酸化的蛋白/因子將是細(xì)胞不同修復(fù)通路選擇的關(guān)鍵因素。通過深入研究，我們發(fā)現(xiàn)BRCA1(Breast Cancer Susceptibility Pro

7、tein1，乳腺癌易感基因1)調(diào)節(jié)S期DNA-PKcs的自磷酸化。在BRCA1缺失的細(xì)胞系HCC1937細(xì)胞中，我們觀察到DNA-PKcs S2056的磷酸化水平在S期和非S期細(xì)胞中相似;但是在表達(dá)BRCA1野生型的HCC1937細(xì)胞中，與非S期細(xì)胞相比，DNA-PKcs S2056的磷酸化水平在S期細(xì)胞中降低了。為揭示BRCA1調(diào)控DNA-PKcs S2506磷酸化的機(jī)制，通過免疫共沉淀技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)BRCA1與DNA-PKcs發(fā)生相

8、互作用，這種相互作用具有細(xì)胞周期依賴性并且不受DNA損傷的影響，而且是非磷酸化依賴的。更進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)分析，我們發(fā)現(xiàn)BRCA1的串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域與DNA-PKcs氨基端的絲氨酸2056簇附近發(fā)生作用。它們之間的相互作用在體內(nèi)和體外直接抑制了DNA-PKcs S2056的自磷酸化并在一定程度上降低了DNA-PKcs的激酶活性。但是，BRCA1的缺失并不影響DNA-PKcs在DSB的聚集和動力學(xué)曲線。最后通過檢測作為HR發(fā)生的標(biāo)志，包括D