自噬缺失激活HSF1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)的分子機(jī)制.pdf

1、背景:自噬（autophagy）是真核生物細(xì)胞內(nèi)去除破損細(xì)胞器和半衰期較長(zhǎng)蛋白質(zhì)的一種生理過程，是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)應(yīng)激反應(yīng)之一，在進(jìn)化上十分保守。自噬根據(jù)發(fā)生過程的不同，可以分為三種：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（CMA）。其中最典型的是巨自噬，其主要是通過形成自噬體并與溶酶體融合成自噬溶酶體來降解細(xì)胞自身物質(zhì)。自噬的發(fā)生主要由自噬相關(guān)基因（ATGs）控制。ATG7是自

2、噬體形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在ATG12和ATG5結(jié)合過程以及LC3的脂化過程中起重要作用，能夠有效的激活自噬，防止錯(cuò)誤折疊蛋白的累積。在正常生理?xiàng)l件下，自噬負(fù)責(zé)去除損壞的或無功能的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，從而給細(xì)胞代謝提供氨基酸和其它必需成分。在應(yīng)激刺激下（如營(yíng)養(yǎng)匱乏，氧化應(yīng)激，有毒化合物，以及病原體的侵入），自噬被激活去除損壞的細(xì)胞內(nèi)組分。自噬對(duì)于細(xì)胞分化和組織重塑必不可少，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的生存和死亡發(fā)揮重要作用。
　　熱休克反應(yīng)是細(xì)胞中另外

3、一種重要的保護(hù)性機(jī)制。熱休克反應(yīng)（HSR）是生物體和細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種外界壓力條件，通過激活熱休克轉(zhuǎn)錄因子（HSFs），調(diào)節(jié)熱休克蛋白（HSPs）的表達(dá)，從而保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種生理過程。已知的熱休克轉(zhuǎn)錄因子有四種：HSF1、HSF2、HSF3和HSF4，其中HSF1是介導(dǎo)熱休克反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。在正常生理?xiàng)l件下，熱休克蛋白的表達(dá)量很少，只占總蛋白的1-2﹪。在熱激、活性氧過多或炎癥的刺激下，Hsf1被激活后結(jié)合到下游熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子

4、上，促進(jìn)熱休克蛋白的表達(dá)，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。熱休克蛋白根據(jù)分子量不同，可以分成兩類：一類是ATP依賴型的大分子HSPs，如HSP100、HSP90、HSP70和HSP60；一類是不依賴ATP的小分子HSPs，如HSP25和αB-crystallin等。在不同的組織或細(xì)胞中，熱休克蛋白的功能具有差異性。有研究表明，HSP70、HSP25和αB-crystallin熱休克蛋白具有抗凋亡的功能。HSP25在亨廷頓氏舞蹈癥的發(fā)生中起重要的

5、保護(hù)作用， HSP25的突變可能會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的病變。
　　近來發(fā)現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子如p53，NF-κB和STAT3在自噬中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。同樣作為轉(zhuǎn)錄因子，HSF1被發(fā)現(xiàn)可以通過直接調(diào)節(jié)ATG7介導(dǎo)自噬來保護(hù)腫瘤細(xì)胞抵抗化療作用。肺腺癌A549細(xì)胞系中過表達(dá)的HSP70可以調(diào)節(jié)mTOR/ Akt信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞自噬。然而，小鼠成纖維細(xì)胞和小鼠近端腎小管細(xì)胞中自噬對(duì)HSF1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)的調(diào)控并不清楚。據(jù)研究報(bào)道，自噬

6、的缺失和許多疾病的發(fā)生相關(guān)，比如肌肉萎縮、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤的發(fā)生以及衰老等。熱休克反應(yīng)和自噬均為細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界環(huán)境壓力的重要保護(hù)性機(jī)制。通過本課題的研究，我們將深入探討HSF1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)是否在自噬缺失的細(xì)胞中存在代償作用。
　　目的:本課題以敲除ATG7的小鼠成纖維細(xì)胞和小鼠近端腎小管細(xì)胞為研究對(duì)象，探究自噬缺失引發(fā)的HSF1介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.應(yīng)用NIH3T3的方法建立ATG7

7、F/F轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞（MEF/ATG7F/F）和敲除ATG7的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF/ATG7-/-），并應(yīng)用免疫印記檢測(cè)兩種細(xì)胞中的自噬和熱休克反應(yīng)水平；
　　2.在應(yīng)激刺激（43℃熱激和MG132處理）處理下，用Real time PCR和免疫印記測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平；
　　3.在不處理和熱休克刺激下進(jìn)行免疫印記測(cè)定小鼠近端腎小管細(xì)胞MPTC/ATG7F/F和MPTC/ATG7-/-中的自噬

8、和熱休克反應(yīng)水平；
　　4.染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）檢測(cè)43℃熱激刺激下兩種穩(wěn)定株細(xì)胞中HSF1和熱休克蛋白基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況；
　　5.分別用細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)和HSF1的三聚化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)探究43℃熱激刺激下HSF1轉(zhuǎn)錄活性激活的分子機(jī)制；
　　6.分別用EBSS和順鉑（cis-platin）處理兩種細(xì)胞，應(yīng)用免疫印跡方法探究敲除ATG7后高表達(dá)的HSP25對(duì)自噬缺失細(xì)胞的作用。
　　結(jié)果:敲除小鼠成纖維細(xì)