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文檔簡介
1、肥胖及相關(guān)代謝疾病正極大地危害著人類健康,而脂肪過量積累是引起肥胖的關(guān)鍵的誘因。組織蛋白酶L(Cathepsin L,CPL)通過降解胞外基質(zhì)而參與飲食誘導(dǎo)的脂肪沉積的過程,但是其是否介導(dǎo)細(xì)胞自噬參與脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制還不清楚。CPL作為溶酶體半胱氨酸蛋白酶主要是在溶酶體中發(fā)揮作用,溶酶體是細(xì)胞內(nèi)酸性細(xì)胞器,溶酶體與自噬小體融合形成自噬溶酶體,從而參與細(xì)胞自噬過程。最近研究表明,細(xì)胞自噬在生物體脂質(zhì)重構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用,但是CPL通過
2、調(diào)控細(xì)胞自噬參與脂肪積累過程的作用還有待確認(rèn)。
為了在模式動(dòng)物秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中研究這一作用,本論文首先擴(kuò)增了線蟲Cpl-1(Cathepsin L-like proteases,CPL-1,Cathepsin L在線蟲中同源基因)基因,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a∷CPL-1,并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá),純化了CPL-1融合蛋白,制備了相應(yīng)的多克隆抗體,經(jīng)EHSA和western blot檢
3、測該抗體具有良好的效價(jià)和專一性。
在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步探討了CPL-1介導(dǎo)細(xì)胞自噬參與了飲食誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積過程的作用。利用LGG-1∷GFP線蟲模式,我們發(fā)現(xiàn)在葡萄糖誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積過程中,細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)都顯著升高。其中,4mM葡萄糖誘導(dǎo)脂肪沉積誘導(dǎo)自噬水平最高。而且,CPL-1與細(xì)胞自噬水平有著很強(qiáng)的相關(guān)性。相應(yīng)地,在高糖飲食誘導(dǎo)下的線蟲cpl-1突變體中,自噬相關(guān)基因表達(dá)顯著降低。最終,通過RNA干擾降低線蟲自噬
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