RIPK2介導(dǎo)自噬對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)的調(diào)控研究.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―iabetic nephropathy,DN）是一種糖尿?。―iabetes mellitus,DM）主要而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)因素參與，近年來(lái)不少研究表明，氧化應(yīng)激及免疫炎癥反應(yīng)可能參與糖尿病腎損害的不同病理過(guò)程并發(fā)揮核心作用。我們的前期研究表明，高糖可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，激活活性氧（Reactive oxygen species, ROS）及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（Nu

2、cleotide binding and oligomerizationdomain-like receptor family pyrin domain-containing3,NLRP3）炎癥小體信號(hào)通路，誘導(dǎo)活半胱氨酸蛋白酶1（Cysteine-aspartic acid protease1,Caspase1）及促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1-β（Interleukine-1 beta,IL-1β）的成熟與分泌。自噬（Autophagy）

3、是一種清除損傷蛋白質(zhì)或細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的降解過(guò)程，通過(guò)清除損傷線粒體減少ROS產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)能量回收，可能參與調(diào)節(jié)ROS及下游的NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，避免過(guò)度的免疫炎癥反應(yīng)。然而到目前為止，高糖刺激下腎系膜細(xì)胞（Glomerular mesangial cell, GMC）的自噬水平及調(diào)節(jié)機(jī)制研究尚少，且研究結(jié)果存在爭(zhēng)議，既往研究表明，適當(dāng)增強(qiáng)自噬可能減少氧化應(yīng)激及免疫炎癥反應(yīng)，但過(guò)度自噬可能引起自噬性細(xì)胞損傷，加重細(xì)胞凋亡。在

4、有限的自噬調(diào)節(jié)機(jī)制研究中，受體結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸激酶2（Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase2,RIPK2），一種Nod樣受體（Nod-like receptor, NLR）家族中Nod1/Nod2的重要連接蛋白，被證明既可激活核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）及絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kina

5、ses,MAPKs）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),還參與Nod1/Nod2介導(dǎo)的自噬反應(yīng)，提示RIPK2可能參與調(diào)節(jié)自噬及ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，但目前尚缺乏研究探討高糖刺激腎系膜細(xì)胞對(duì)RIPK2以及RIPK2與自噬、ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響，因此本研究通過(guò)觀察小鼠腎系膜細(xì)胞中RIPK2、LC3II/I、ROS、Caspase1、IL-1β在不同時(shí)間及不同濃度高糖干預(yù)下的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β表達(dá)，再

6、通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2-siRNA干擾RIPK2后再次觀察自噬水平及ROS-NLRP3炎癥小體關(guān)鍵因子的改變，旨在探討高糖對(duì)腎系膜細(xì)胞RIPK2、自噬的影響以及自噬對(duì)ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的調(diào)控作用，為DN的防治提供新的思路。
　　方法：
　　（1）細(xì)胞培養(yǎng)及分組：體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞（SV40），以高糖作為刺激因素，分為以下三組：①正常對(duì)照組(Normal control group,NC組)：培養(yǎng)基含5

7、.6mmol/L葡萄糖；②滲透壓對(duì)照組(Osmotic pressure group, OP組)：培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇。③不同高糖濃度干預(yù)組(High glucose group, HG組)：培養(yǎng)基分別含10mmol/L葡萄糖（HG1組）、20mmol/L葡萄糖（HG2組）、30mmol/L葡萄糖（HG3組）；
　?。?）各組細(xì)胞培養(yǎng)0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后，用W

8、estern-blot檢測(cè)RIPK2、LC3II/I、Caspase1、IL-1β的蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)RIPK2、Caspase1、IL-1βmRNA表達(dá)；mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒標(biāo)記LC3以觀察自噬流；各組細(xì)胞適時(shí)隨機(jī)加入處理因素后裝載2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針(2’,7’-Dichlorofluorescin Diacetate,DCFH—DA)，并用分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化；ELISA檢測(cè)

9、培養(yǎng)上清液IL-1β濃度。
　?。?）RIPK2的siRNA干擾研究：篩選出最佳高糖作用濃度（30mmol/L）和時(shí)間（12h）后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA，再次進(jìn)行分組：①siNC組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染control siRNA加入含5.6mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；②siRIPK2組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA加入含5.6mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；③HG+siNC組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染control siRNA加入含3

10、0mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；④HG+siRIPK2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA加入含30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；再次采用Western-blot、RT-PCR、 mRFP-GFP-LC3標(biāo)記+共聚焦顯微鏡、DCFH—DA標(biāo)記+分光光度計(jì)及ELISA等方法檢測(cè)上述指標(biāo)。
　?。?）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分

11、析對(duì)多組間均數(shù)進(jìn)行比較，組間多重比較用LSD—t法。我們定義P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　（1）與NC組相比，高糖刺激可增加細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量、Caspase1、IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，且具有時(shí)間及濃度依賴性。
　?。?）與NC組相比，高糖在短期作用時(shí)間內(nèi)（0-12h）可誘導(dǎo)RIPK2、LC3II/I蛋白及RIPK2mRNA表達(dá)(P<0.05)，且在3

12、0 mmol/L高糖作用12h條件下表達(dá)顯著增強(qiáng)，超過(guò)12h作用時(shí)間后RIPK2及LC3II/I表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。
　?。?）細(xì)胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA后成功抑制RIPK2表達(dá)。與siNC組相比， siRIPK2組LC3II/I表達(dá)顯著下調(diào)，而細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量、Caspase1及IL-1β蛋白表達(dá)則顯著增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　?。?）高糖可激活小鼠腎系膜細(xì)胞ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路。