血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖及炎癥介質(zhì)表達(dá)的信號(hào)機(jī)制研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活方式的改變，人類(lèi)疾病譜正在發(fā)生變化，慢性腎臟病(CKD)已呈現(xiàn)流行特征，并成為21世紀(jì)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。CKD一旦發(fā)展為終末期腎臟病(ESRD)，則必須依賴(lài)腎臟替代治療(RRT)，即血液透析、腹膜透析、或腎移植來(lái)維持生命，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力。因此，早期診斷及防治慢性腎臟病有著特殊重要的意義。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，尤其是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在CKD的

2、發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。AngⅡ是RAAS系統(tǒng)最主要的效應(yīng)分子，業(yè)已證實(shí)AngⅡ不僅通過(guò)改變腎小球血流動(dòng)力學(xué)促進(jìn)腎小球硬化，還可促進(jìn)系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞增生、生長(zhǎng)因子表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)積聚。Ang Ⅱ的作用是通過(guò)與Gq蛋白偶聯(lián)的Ⅰ型血管緊張素受體(AT1受體)完成的，而AT1受體為跨膜糖蛋白，本身不具有酪氨酸激酶(此酶介導(dǎo)有絲分裂的細(xì)胞信號(hào))活性，也不直接與酪氨酸激酶發(fā)生聯(lián)系。本研究將深入探討Ang Ⅱ介導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增

3、殖及炎癥介質(zhì)的表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，這不僅有助于加深人們對(duì)CKD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為未來(lái)CKD治療策略的制定提供理論依據(jù)。 本研究包括兩部分內(nèi)容： 一、c-Jun氨基末端激酶介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞增殖及炎癥介質(zhì)表達(dá) 目的：AngⅡ可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)活化，但其活化后的生物學(xué)意義仍不清楚。本研究選用新型的JNK特異性阻斷劑SP-600125，探討JNK-c-Ju

4、n/AP-1信號(hào)通路在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖及炎癥介質(zhì)表達(dá)中的作用。 方法：體外分離培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，應(yīng)用SP-600125預(yù)處理后加入AngⅡ刺激，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)JNK、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)和p38的活性以及c-Jun磷酸化；應(yīng)用熒光素酶(Luciferase)活性檢測(cè)法檢測(cè)c-Jun轉(zhuǎn)錄活性及單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)啟動(dòng)子活性；凝膠電泳遷移率(EMSA)檢測(cè)活化蛋白-1(

5、AP-1)DNA結(jié)合活性；核酸酶保護(hù)法檢測(cè)MCP-1 mRNA表達(dá)；ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中MCP-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)和纖維連接蛋白(FN)的分泌；3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)摻入法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定系膜細(xì)胞的增殖。 結(jié)果：1.AngⅡ可呈時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)JNK活化及c-Jun磷酸化，100 nmol/L Ang Ⅱ刺激15 min后，c-Jun磷酸化顯著增加，JNK活性明顯上調(diào)，30分鐘達(dá)到高峰，

6、是對(duì)照組的6.2倍，1 h后幾乎恢復(fù)到正常水平。 2.JNK特異性抑制劑SP-600125呈劑量依賴(lài)性的方式抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的JNK活化和c-Jun磷酸化，當(dāng)濃度為10μmol/L和20μmol/L時(shí)其抑制作用分別達(dá)75％和90％，SP-600 125對(duì)ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平均無(wú)抑制作用。 3.AngⅡ刺激后c-Jun轉(zhuǎn)錄活性及AP-1 DNA結(jié)合活性顯著增加，SP-600 125可呈劑量依賴(lài)的抑制A

7、ng Ⅱ誘導(dǎo)的c-Jun轉(zhuǎn)錄活性及AP-1 DNA結(jié)合活性的增加，20μmol/L SP-600125預(yù)處理幾乎完全阻斷c-Jun的反式激活。4.AngⅡ顯著增加MCP-1啟動(dòng)子活性及MCP-1 mRNA表達(dá)，SP-600125可呈劑量依賴(lài)性的抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的MCP-1啟動(dòng)子活化和MCP-1 mRNA表達(dá)以及系膜細(xì)胞MCP-1、TGF-β和FN的分泌。5.1～20 μmol/L SP-600125以劑量依賴(lài)的方式抑制Ang Ⅱ促進(jìn)的

8、系膜細(xì)胞3H-TdR摻入量和細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加，而MEK1/2特異性抑制劑PD-98059和p38 MAPK特異性抑制劑SB-203580對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞數(shù)目的增加無(wú)抑制作用。 結(jié)論：Ang Ⅱ→JNK/SAPK→c-Jun/AP-1信號(hào)通路在系膜細(xì)胞增殖和炎癥介質(zhì)分泌中發(fā)揮一定的作用。JNK特異性抑制劑SP-600125能部分抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖和炎癥介質(zhì)分泌。 二、血管緊張素Ⅱ通過(guò)Ros/EGFR/

9、JNK/AP-1信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖 目的：我們前期的研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ可通過(guò)JNK/AP-1信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖，但JNK/AP-1活化的上游通路尚不清楚。本研究探討活性氧(ROS)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的JNK/AP-1活化及系膜細(xì)胞增殖中的作用并探討ROS釋放的來(lái)源。 方法：體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，應(yīng)用3H-TdR摻入法和細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定系膜細(xì)胞增殖；熒光探針2，7-二氯二

10、氫熒光素乙酰乙酸(DCFDA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性；實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)NADPH亞基p47phox和p67phox mRNA表達(dá)；Western Blot檢測(cè)p47phox和p67phox膜轉(zhuǎn)位以及EGFR、JNK和c-Jun磷酸化。 結(jié)果：1、Ang Ⅱ呈時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞ROS產(chǎn)生。Ang Ⅱ刺激3 min，系膜細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯

11、增加，至60 min達(dá)到高峰，系膜細(xì)胞ROS產(chǎn)生是對(duì)照組2.26倍；1、10、100nmol/L Ang Ⅱ刺激60 min，ROS產(chǎn)生分別是對(duì)照組的1.82、2.92和4.08倍。AT1受體(AT1R)拮抗劑losartan完全阻斷了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，而AT2受體(AT2R)拮抗劑PD123319無(wú)抑制作用。2、NADPH氧化酶抑制劑apocynin和DPI幾乎完全阻斷Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，而線粒體complex Ⅰ抑

12、制劑魚(yú)藤酮(rotenone，ROT)、黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(allopurinol，ALLO)、環(huán)氧化酶抑制劑吲哚美辛(indomethacin，INDO)、脂氧化酶抑制劑(nordmydroguiaretic acid，NDGA)、細(xì)胞色素P450氧化酶抑制劑酮康唑(ketoconazole，KETO)以及一氧化氮合成酶抑制劑N-硝基-L-甲酯精氨酸(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAM

13、E)對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生均無(wú)明顯影響。Ang Ⅱ顯著刺激NADPH氧化酶活化及p47phox和p67phox膜轉(zhuǎn)位。3、Ang Ⅱ可呈時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)系膜細(xì)胞EGFR磷酸化，100 nmol/L Ang Ⅱ刺激30 min，EGFR磷酸化達(dá)到高峰，是對(duì)照組的3.96倍；AT1受體阻斷劑losartan、抗氧化劑乙酰半胱氨酸(NAC)以及NADPH氧化酶抑制劑apocynin和DPI著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的EGFR磷酸化，

14、同時(shí)EGFR拮抗劑AG-1478幾乎完全阻斷Ang Ⅱ誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖。4、Losartan、NAC、apocynin、DPI和AG-1478阻斷Ang Ⅱ誘導(dǎo)的JNK/AP-1活化和系膜細(xì)胞增殖。 結(jié)論：ROS/EGFR/JNKYAP-1信號(hào)通路參與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的。腎小球系膜細(xì)胞增殖。NADPH氧化酶抑制劑和EGFR受體拮抗劑能顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，可能具有一定的治療作用。 本研究創(chuàng)新之處在於：

15、 1.首次發(fā)現(xiàn)：Ang Ⅱ可通過(guò)JNK-c-Jun/AP-1信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖和MCP-1、TGF-β以及FN表達(dá)(參見(jiàn)：ZhangA，Ding G,Huang S，Wu Y,Pan X，Guan X，Chen R,Yang T.c-Jun NH2-temainal kinase medimionof angiotensin Ⅱ-induced proliferation of human mesangial cells

16、 Am J PhysiolRenal Physi01.2005；288：F111 8-1124)。 2.首次發(fā)現(xiàn)：活性氧依賴(lài)的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體磷酸化介導(dǎo)Ang Ⅱ誘導(dǎo)JNK-c-Jun/AP-1信號(hào)通路活化及腎小球系膜細(xì)胞增殖(參見(jiàn)：Ding G,Zhang A，Huang S，Pan X，Zhen G ,Chen R，Yang T.ANG Ⅱ induces c-JunNH2-terminal kinase activat