高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞Toll樣受體4與血管緊張素Ⅱ的對(duì)話關(guān)系及其天然免疫應(yīng)答炎癥效應(yīng).pdf

1、目的：
　　探討高糖和血管緊張素Ⅱ刺激下腎小球系膜細(xì)胞 TLR4及其信號(hào)通路中下游因子MyD88、NF-κB以及炎性因子的表達(dá)變化，并運(yùn)用TLR4 RNA干擾技術(shù)、血管緊張素受體拮抗劑（ARB類藥物）干預(yù)高糖及血管緊張素Ⅱ（10-7 M）刺激后的的系膜細(xì)胞，分析TLR4及其下游信號(hào)分子的表達(dá)改變，論證高糖環(huán)境下AngⅡ與TLR4的對(duì)話關(guān)系及其天然免疫炎癥效應(yīng)，以闡明TLR4信號(hào)通路在DN發(fā)病機(jī)制中的具體作用。
　　方法：

2、r>　　常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞后將細(xì)胞分4組：1、低糖組2、高糖組3、血管緊張素Ⅱ組4、甘露醇組，24小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白。western blot檢測(cè)TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表達(dá)水平的變化，分析高滲狀態(tài)對(duì)TLR4/MyD88信號(hào)通路的影響。
　　設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)大鼠TLR4基因的特異性siRNA片段以及帶有綠色熒光的陰性對(duì)照。篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的 siRNA，用于后續(xù)試驗(yàn)，將正常培養(yǎng)的細(xì)胞分為：
　　第一組：1、低糖組2、高

3、糖組3、高糖+血管緊張素Ⅱ組4、高糖+ARB組5、高糖+TLR4siRNA組6、高糖+ScSiRNA組。
　　第二組：1、低糖組2、血管緊張素Ⅱ組3、高糖+血管緊張素Ⅱ組4、血管緊張素Ⅱ+ARB組5、血管緊張素Ⅱ+TLR4 siRNA組6、血管緊張素Ⅱ+ScSiRNA組。
　　采用熒光定量PCR檢測(cè)各組TLR4、MyD88mRNA的表達(dá)，western blot檢測(cè)TLR4、MyD88及NF-kB蛋白表達(dá)水平的變化，ELIS

4、A法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6、及MCP-1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　與正常組相比，高糖及AngⅡ都可以上調(diào)TLR4、MyD88及NF-kB蛋白及TLR4、MyD88mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05），IL-6及MCP-1的表達(dá)也明顯升高（P＜0.01），二者協(xié)同刺激情況下上訴指標(biāo)上調(diào)更明顯。與高糖、AngⅡ組及高糖+AngⅡ組比較，厄貝沙坦及TLR4siRNA可顯著抑制上述指標(biāo)的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與

5、高糖組及AngⅡ組比較，ScSiRNA組上訴指標(biāo)改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞TLR4/MyD88信號(hào)通路被激活，特異性TLR4siRNA基因可以部分阻斷由高糖及AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)的激活，厄貝沙坦也可部分阻斷TLR4信號(hào)通路，高糖和AngⅡ共刺激增強(qiáng)由TLR4介導(dǎo)的天然免疫炎癥效應(yīng)；以上說明高糖條件下AngⅡ作為天然免疫信號(hào)肽，與TLR4存在對(duì)話關(guān)系。這為臨床上使用ARB延緩糖