FBW7對(duì)高糖誘導(dǎo)腎系膜細(xì)胞自噬信號(hào)的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：20％～40%糖尿病患者可能會(huì)發(fā)生糖尿病腎病,最后發(fā)展為腎功能衰竭尿毒癥。強(qiáng)化血糖控制可以延緩糖尿病腎病的發(fā)生，但高血糖狀態(tài)下引起腎臟病變的機(jī)制尚未明確。目前研究表明自噬參與了糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展，自噬可以降解衰老的細(xì)胞器、多余的蛋白、有害的細(xì)胞質(zhì)成分,有研究表明糖尿病腎病的小鼠比正常小鼠自噬水平低。調(diào)節(jié)自噬信號(hào)最經(jīng)典的負(fù)調(diào)控信號(hào)途徑是P13K-Akt-mTOR，mTOR可作為FBW7的底物蛋白，能被泛素化修飾并被蛋白酶體降解，F(xiàn)B

2、W7是SCF型(Skp1–Cullin1–F-box protein) E3泛素連接酶的識(shí)別亞基。糖尿病mTOR信號(hào)分子究竟如何表達(dá)，F(xiàn)BW7是否參與了對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)進(jìn)而參與了糖尿病腎病的發(fā)生？為此，我們體外培養(yǎng)腎系膜細(xì)胞，研究高糖對(duì)FBW7表達(dá)的影響及其對(duì)自噬信號(hào)的調(diào)控作用，為深入研究糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）不同濃度葡萄糖對(duì)腎系膜細(xì)胞FBW7、LC3-II/I、mTOR、p-mTOR、

3、I型膠原蛋白（Col-I）、IL-1β、caspase-1表達(dá)以及自噬溶酶體的影響:將小鼠腎系膜細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)72h，分組如下①正常糖組(NC)；②滲透壓對(duì)照組（OP）；③高糖干預(yù)組(10mmol/L葡萄糖，HG1組)；④高糖干預(yù)組(20mmol/L葡萄糖，HG2組)；⑤高糖干預(yù)組(30mmol/L葡萄糖，HG3組)。采用western blot檢測(cè)FBW7、mTOR、p-mTOR的表達(dá)水平以及LC3-II/I比值，采用RT-PCR進(jìn)

4、一步檢測(cè)FBW7的mRNA水平；采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬溶酶體；采用ELISA檢測(cè)Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)。
　?。?）不同時(shí)間高糖對(duì)腎系膜細(xì)胞LC3-II/I、FBW7、mTOR、p-mTOR、自噬溶酶體、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)的影響：以5．6 mmol/L葡萄糖為對(duì)照，用30mmol/L高糖分別對(duì)小鼠腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞干預(yù)2h、6h、12h、24h、48h、72h，并采用上述技

5、術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　?。?）雷帕霉素干預(yù)對(duì)腎系膜細(xì)胞mTOR、p-mTOR、LC3-II/I、Col-I、IL-1β、caspase-1、自噬溶酶體的影響：將小鼠腎小球系膜細(xì)胞體外培養(yǎng)72h，使用雷帕霉素抑制mTOR。分組如下①NC組；②NC-RAPA3組；③HG3組；④HG3-RAPA3組。采用上述技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　　（4）基因沉默F(xiàn)BW7對(duì)系膜細(xì)胞mTOR、p-mTOR、LC3-II/I、

6、自噬溶酶體、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)的影響：選擇自噬最強(qiáng)的條件進(jìn)行基因沉默F(xiàn)BW7，分組如下①NC組;②NC-si FBW7組；③HG3組；④HG3-si FBW7組。采用上述技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　?。?）過表達(dá) FBW7對(duì)系膜細(xì)胞FBW7、LC3-II/I、mTOR、p-mTOR、自噬溶酶體、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)的影響：選擇自噬最弱的條件進(jìn)行過表達(dá) FBW7實(shí)驗(yàn)，分組

7、如下①NC-LV-CON238組；②NC-LV- FBW7組；③HG3-LV-CON238組；④HG3-LV-FBW7組。采用上述技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白水平及自噬水平。
　　結(jié)果：
　?、僖圆煌瑵舛鹊钠咸烟浅掷m(xù)刺激小鼠腎小球系膜細(xì)胞72小時(shí)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度越高，F(xiàn)BW7、LC3-II/I比值和自噬溶酶體表達(dá)水平越低，mTOR、p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1的表達(dá)水平越高(P<0．05)。
　　②30

8、mmol/L高糖分別對(duì)小鼠腎系膜細(xì)胞刺激2h、6h、12h、24h、48h、72h，發(fā)現(xiàn)12h組FBW7、LC3-II/I比值和自噬溶酶體顯著增加，mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)顯著減少(P<0．05)。72h組FBW7、LC3-II/I比值和自噬溶酶體表達(dá)顯著減少，mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)顯著增加(P<0．05)。自噬活性最強(qiáng)的刺激條件30mmol/L葡萄糖刺激12小時(shí)，自噬活性最弱的條件

9、是30mmol/L葡萄糖刺激72小時(shí)。③雷帕霉素干預(yù)高糖刺激的腎系膜細(xì)胞，mTOR、p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)顯著減少，LC3-II/I比值顯著增加，自噬溶酶體數(shù)目顯著增加(P<0．05)。④基因沉默F(xiàn)BW7可使FBW7、LC3-II/I比值顯著減少，mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)顯著增加，自噬溶酶體數(shù)目顯著減少(P<0．05)。⑤過表達(dá)FBW7實(shí)驗(yàn)可使FBW7、

10、LC3-II/I比值顯著增加，mTOR和p-mTOR、Col-I、IL-1β、caspase-1表達(dá)顯著減少，自噬溶酶體數(shù)目顯著增加(P<0．05)。
　　結(jié)論：
　　1.短時(shí)間的高糖刺激可以上調(diào)FBW7表達(dá)，抑制mTOR，引起小鼠腎系膜細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，可能對(duì)早期糖尿病腎臟有保護(hù)作用。
　　2.長(zhǎng)時(shí)間高糖刺激可以下調(diào)FBW7表達(dá)激活mTOR，引起小鼠腎系膜細(xì)胞自噬水平的降低，可能參與腎臟炎癥和纖維化的形成。