糖腎飲對高糖中大鼠腎系膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重和最常見的慢性并發(fā)癥之一，我國1型糖尿病患者DN的患病率約為30％-40％，2型糖尿病約為15％-20％，若不積極治療，最終可發(fā)展為終末期腎衰竭(endstagerenaldisease，ESRD)，如何有效地預(yù)防和治療DN是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題。DN發(fā)病機(jī)制還不十分明確，長期高血糖是DN發(fā)生的最關(guān)鍵原因，還可能與脂代謝紊亂和血管活性物質(zhì)、生長因子、細(xì)胞

2、因子等激活有關(guān)。DN的基本病變是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)積聚，其主要原因是由于ECM合成增加和降解減少，針對如何遏止或減少ECM的積聚研究日益受到重視，腎小球系膜細(xì)胞是分泌、產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞之一，對糖尿病腎病病理改變起著重要作用。高血糖對系膜細(xì)胞的影響在糖尿病性腎小球硬化中起重要作用，一方面高糖刺激磷酸肌酸激酶(proteinkinaseC，PKC)活性增加和轉(zhuǎn)化生長因子β(transf

3、orminggrowthfactor-beta，TGF-β)及糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，另一方面近年來又發(fā)現(xiàn)高糖或糖尿病能使系膜細(xì)胞的基質(zhì)降解能力明顯下降，早先的研究主要集中在ECM合成方面，而系膜細(xì)胞降解能力下降在DN發(fā)病中的重要地位是近期才開始受到關(guān)注。并有學(xué)者認(rèn)為糖尿病時基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，M

4、MPs)在系膜基質(zhì)降解中起主要作用，由于Ⅳ型膠原是糖尿病腎病系膜區(qū)積聚的最主要基質(zhì)成分，而MMP-2又是降解Ⅳ型膠原的主要MMP，因此對MMP-2的研究成為當(dāng)前的熱點。文獻(xiàn)報道30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞產(chǎn)生的MMP-2活性較10mmol/L糖培養(yǎng)的明顯降低，這可能也是導(dǎo)致DN中細(xì)胞外基質(zhì)積聚的重要原因之一。DN發(fā)生率高，當(dāng)前治療效果不佳，迄今為止尚無有效的西藥能阻止DN腎功能損害的自然進(jìn)程，在治療上也有一定的局限性和不良反應(yīng)。

5、中藥具備多靶點、多層次結(jié)合治療作用和功能調(diào)節(jié)作用，對糖尿病的治療不僅僅針對降低血糖，還在于能有效地阻止和延緩DCC的發(fā)生和發(fā)展。如何應(yīng)用中醫(yī)中藥延緩其病程進(jìn)展已引起廣大學(xué)者的關(guān)注，近年來，中醫(yī)藥在防治DN的研究方面做了大量的工作。資料表明生地黃、山藥、茯苓、赤芍、澤瀉、山萸肉、黃連、葛根等可調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善微循環(huán)，抑制腎系膜增生保護(hù)腎功能，但單味藥療效不佳，中藥復(fù)方制劑在臨床上使用日益廣泛，而大多機(jī)理不清楚。為此，本課題選用上述中藥組

6、成的復(fù)方制劑糖腎飲觀察其對腎臟保護(hù)作用，體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，并運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，利用高糖為刺激物，造成了系膜細(xì)胞的急性反應(yīng)，觀察高葡萄糖環(huán)境中糖腎飲對大鼠腎小球系膜細(xì)胞MMP-2的影響，了解糖腎飲對DN作用的可能機(jī)制，為探索糖尿病腎病防治的新途徑奠定基礎(chǔ)。 方法：將10只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成2組：實驗組(n=5)，用糖腎飲進(jìn)行灌胃，正常對照組(n=5)用等量生理鹽水灌胃2周，于末次灌胃2h后，用5％水合氯醛腹腔

7、內(nèi)注射麻醉，下腔靜脈取血，離心取血清，分別制成正常血清和中藥復(fù)方糖腎飲血清，分裝凍存。采用體外培養(yǎng)法培養(yǎng)正常大鼠腎小球系膜細(xì)胞，將系膜細(xì)胞以3×104/孔接種于是24孔板內(nèi)，每孔1m1，孵育24h后換成無血清培養(yǎng)液再孵育24h使細(xì)胞同步化，棄上清液，將已孵育2次的系膜細(xì)胞分為A、B、C、D、E、F、G、H8個組，用含有血清和葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)，其濃度分別為A組：10％正常血清低糖，B組：20％正常血清低糖，C組：10％正常血清高糖，D組

8、：20％正常血清高糖，E組：10％糖腎飲血清低糖，F(xiàn)組：20％糖腎飲血清低糖，G組：10％糖腎飲血清高糖，H組：20％糖腎飲血清高糖，以上各組中高糖葡萄糖的濃度為30mmol/L，低糖葡萄糖的濃度為5.6mmol/L，48h后吸取各組系膜細(xì)胞上清液，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測MMP-2含量。 結(jié)果：1.各組系膜細(xì)胞上清液MMP-2濃度分別為：25.92±0.78ng/ml、25.88±0.54ng/ml、23.36±0.77

9、ng/ml、23.21±0.81ng/ml、25.74±0.76ng/ml、25.96±0.87ng/ml、24.23±0.63ng/ml、25.01±0.59ng/ml。 2.正常大鼠血清對系膜細(xì)胞上清液MMP-2濃度影響：A組MMP-2濃度與B組差異無顯著性(t=0.22，P＞0.05)，C組MMP-2濃度與D組差異無顯著性(t=0.60，P＞0.05)，表明大鼠腎系膜細(xì)胞可分泌MMP-2，正常血清對低糖、高糖培養(yǎng)的大鼠腎系

10、膜細(xì)胞MMP-2表達(dá)無影響。 3.高糖對系膜細(xì)胞上清液MMP-2濃度影響：正常血清高糖組MMP-2濃度較正常血清低糖組明顯下降(t=10.17，P＜0.01)，表明高糖可明顯降低體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞上清液MMP-2表達(dá)。 4.糖腎飲血清對系膜細(xì)胞上清液MMP-2濃度影響：G組和H組MMP-2濃度較C組均有不同程度上升(F=4.91，P＜0.05)，G組MMP-2濃度與C組差異有顯著性(q=4.37，P＜0.05)，H

11、組MMP-2濃度與C組差異有顯著性(q=6.12，P＜0.01)，且MMP-2濃度隨糖腎飲血清濃度增加而增加，H組MMP-2濃度與G組差異有顯著性(q=4.21，P＜0.05)，表明糖腎飲血清可提高高糖培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞上清液中MMP-2含量，并有一定量效關(guān)系。 結(jié)論：1.大鼠腎系膜細(xì)胞可分泌MMP-2，正常血清對低糖、高糖培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞MMP-2表達(dá)均無影響； 2.高糖可抑制大鼠腎系膜細(xì)胞分泌MMP-2；