黃芪甲苷對(duì)高糖所致人腎小球系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其調(diào)控NADPH氧化酶-ROS-Akt-NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎?。―iabetic nephropathy, DN）是糖尿?。―iabetes Mellitus, DM）最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病率隨著糖尿病病程的延長而升高。部分DN患者會(huì)進(jìn)展為終末期腎?。‥nd-stage renal disease, ESRD），引起腎功能衰竭和腎移植，甚至導(dǎo)致患者死亡。
　　目前DN發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，但其發(fā)病初期顯著的病理特征是腎小球系膜細(xì)胞（mesangial cells,

2、MCs）增生所致的腎小球肥大和MCs收縮功能障礙引起的腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，GFR）的升高。高糖狀態(tài)下機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，活性氧（Reactive oxygen species, ROS）生成增多。NADPH氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH oxidase）是MCs中ROS的主要來源，Nox4是MCs中最重要的NA

3、DPH氧化酶亞基。NADPH氧化酶Nox4源性ROS參與了高糖誘導(dǎo)的MCs異常增殖。Akt/ NF-κB信號(hào)通路在高糖所致的MCs損傷中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，且與NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS生成密切相關(guān)。上述通路還參與了瞬時(shí)受體電位陽離子通道6（Canonical Transient Receptor Potential6, TRPC6）的調(diào)節(jié)，高糖環(huán)境下TRPC6蛋白表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流減少是MCs收縮功能受損的主要原因。雖然對(duì)

4、于DN的防治研究已不斷深入，但尋找安全有效的治療方法和藥物仍是當(dāng)務(wù)之急。
　　黃芪為臨床常用中藥，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗缺血性腦損傷等多種藥理活性。黃芪甲苷（AstragalosidesⅣ，AS-Ⅳ）是從黃芪中提取的主要皂苷類活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ能有效減輕糖尿病大鼠的白蛋白尿，并能有效抑制其氧化應(yīng)激損傷。黃芪甲苷對(duì)于體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞的影響目前尚不十分明確。本研究旨在考察高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞損傷的具體機(jī)制及其

5、黃芪甲苷的干預(yù)作用，以期為臨床治療糖尿病腎病提供有效的候選藥物和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　考察高糖對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖情況和TRPC6蛋白表達(dá)水平及鈣離子內(nèi)流的影響，并探討其對(duì)NADPH氧化酶/ ROS/ Akt/ NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，考察黃芪甲苷對(duì)高糖所致人腎小球系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其干預(yù)機(jī)制，為糖尿病腎病的理論研究和臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)

6、胞分為以下3組：（1）正常對(duì)照（NG:5.6 mM葡萄糖）組、（2）滲透壓對(duì)照（MA:NG+24.5 mM甘露醇）組、（3）高糖（HG:25 mM葡萄糖）組，采用MTT檢測(cè)各組細(xì)胞在孵育24 h、48 h、72 h、96 h后的增殖情況。
　　2.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG6 h組，（3）HG12 h組，（4）HG24 h組，（5）HG36 h組，（6）HG48 h組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR

7、法檢測(cè)各組細(xì)胞Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達(dá)水平，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表達(dá)水平。
　　3.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下7組：（1）NG組，（2）HG0.5 h組，（3）HG1 h組，（4）HG3 h組，（5）HG12 h組，（6）HG24 h組，（7）HG48 h組。采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。
　　

8、4.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG組，（2）NG+Tempol100μM組，（3）NG+DPI10μM組，（4）HG組，（5）HG+Tempol100μM組，（6） HG+DPI10μM組，給藥48 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力，采用 DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)各組細(xì)胞 ROS水平，采用光度法檢測(cè)各組細(xì)胞NADPH氧化酶活性。
　　5.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG組，（2

9、）NG+FAMsiRNA組，（3）NG+Nox4 siRNA組，（4）HG組，（5）HG+FAM siRNA組，（6）HG+Nox4 siRNA組。刺激48 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力，采用DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平，采用光度法檢測(cè)各組細(xì)胞 NADPH氧化酶活性，采用 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞 Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表達(dá)水平。
　　6.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組

10、：（1）NG組，（2）NG+FAMsiRNA組，（3）NG+IκBαsiRNA組，（4）HG組，（5）HG+FAM siRNA組，（6）HG+IκBαsiRNA組。刺激48 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力，采用DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平，采用光度法檢測(cè)各組細(xì)胞NADPH氧化酶活性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達(dá)水平，采用 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)

11、胞 Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表達(dá)水平以及 Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。
　　7.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG+LY29400210μM組，（4）HG+DPI10μM組，（5）HG+Tempol100μM組，（6）HG+Sul500μM組，給藥48 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力，采用DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平，采用光

12、度法檢測(cè)各組細(xì)胞 NADPH氧化酶活性，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達(dá)水平，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表達(dá)水平以及 Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。采用Fluo-3/AM熒光探針法檢測(cè)各組細(xì)胞的游離鈣離子濃度。
　　8.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下9組：（1）NG組，（2）MA組，（3）HG組，（

13、4）HG+AS-Ⅳ5μM組，（5）HG+AS-Ⅳ10μM組，（6）HG+AS-Ⅳ25μM組，（7）HG+AS-Ⅳ50μM組，（8）HG+AS-Ⅳ100μM組，（9） HG+0.5％DMSO組。給藥48 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
　　9.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下9組：（1）NG組，（2）MA組，（3）HG組，（4）HG+AS-Ⅳ5μM組，（5）HG+AS-Ⅳ10μM組，（6）HG+AS-Ⅳ25μM組，（

14、7）HG+AS-Ⅳ50μM組，（8）HG+AS-Ⅳ100μM組，（9）HG+0.5% DMSO組。給藥48 h后，通過計(jì)算細(xì)胞總蛋白/細(xì)胞數(shù)的比值考察各組細(xì)胞的肥大情況。
　　10.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下7組：（1）NG組，（2）NG+AS-Ⅳ5μM組，（3）NG+AS-Ⅳ10μM組，（4）NG+AS-Ⅳ25μM組，（5）NG+AS-Ⅳ50μM組，（6）NG+AS-Ⅳ100μM組，（7）NG+0.5%DMSO組。給藥

15、48 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活力，考察黃芪甲苷藥物本身有無細(xì)胞毒性。
　　11.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+Tempol100μM組，給藥48 h后，采用DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平。
　　12.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）

16、NG組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+OAG100μM組，給藥48 h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的TRPC6 mRNA的表達(dá)水平，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的TRPC6蛋白的表達(dá)水平，采用Fluo-3/AM熒光探針法檢測(cè)各組細(xì)胞的游離鈣離子濃度。
　　13.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG

17、組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+DPI10μM組，給藥48 h后，采用光度法檢測(cè)各組細(xì)胞NADPH氧化酶活性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4 mRNA的表達(dá)水平，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4蛋白的表達(dá)水平。
　　14.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG

18、+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+LY2940010μM組，給藥48 h后，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Akt蛋白的磷酸化水平。
　　15.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+Sul500μM組，給藥48h后，

19、采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。
　　結(jié)果：
　　1.高糖培養(yǎng)一定時(shí)間后人腎小球系膜細(xì)胞的增殖活力顯著升高，細(xì)胞明顯肥大。但給予甘露醇的系膜細(xì)胞活力沒有明顯變化，表明高糖的上述作用并非由于其高滲透壓所致。高糖還能明顯增強(qiáng)人腎小球系膜細(xì)胞中NADPH氧化酶的活性，促進(jìn)ROS的生成。高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用能夠被NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑有效抑制。
　　2.高糖培養(yǎng)

20、一定時(shí)間后人腎小球系膜細(xì)胞中NADPH氧化酶亞基Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。采用RNAi技術(shù)特異性沉默Nox4基因后，高糖環(huán)境下人腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的活性和ROS的生成均顯著降低，且細(xì)胞增殖也受明顯抑制，提示高糖促系膜細(xì)胞增殖作用可能是通過上調(diào) Nox4亞基的表達(dá)，從而促進(jìn)NADPH氧化酶活化和ROS生成來實(shí)現(xiàn)的。
　　3.高糖培養(yǎng)一定時(shí)間后人腎小球系膜細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化

21、和降解水平顯著上調(diào)，激活A(yù)kt/NF-κB信號(hào)通路。NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑均能顯著抑制高糖環(huán)境下人腎小球系膜細(xì)胞中Akt和NF-κB的活化，提示高糖對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞中Akt/ NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用與NADPH氧化酶性ROS具有緊密的相關(guān)性。Akt抑制劑能顯著抑制高糖環(huán)境下人腎小球系膜細(xì)胞中Nox4蛋白的表達(dá)水平并抑制NADPH氧化酶性ROS的生成，還能有效抑制IκBα蛋白的磷酸化和降解，以及細(xì)胞增殖水平，而IκB

22、α表達(dá)被抑制時(shí)對(duì)高糖環(huán)境下MCs中Akt蛋白的磷酸化水平、Nox4蛋白表達(dá)水平、NADPH氧化酶活性以及ROS水平均沒有明顯影響，僅抑制細(xì)胞異常增殖。提示在上述信號(hào)通路中Akt活化與NADPH氧化酶性ROS生成可能是相互平行或相互交叉影響，并共同參與促進(jìn)NF-κB的活化。
　　4.高糖培養(yǎng)一定時(shí)間后人腎小球系膜細(xì)胞中TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，鈣離子內(nèi)流顯著減少。當(dāng)Nox4或IκBα表達(dá)被抑制時(shí)，高糖下調(diào)的TRPC

23、6蛋白表達(dá)水平顯著升高；此外當(dāng)采用NADPH氧化酶抑制劑、ROS抑制劑、Akt抑制劑以及 IκBα抑制劑時(shí)均能顯著增強(qiáng)高糖環(huán)境下人腎小球系膜細(xì)胞中TRPC6蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，提示高糖可能是通過激活NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞中TRPC6蛋白表達(dá)和鈣離子內(nèi)流的抑制作用，從而導(dǎo)致系膜細(xì)胞收縮功能障礙。
　　5.黃芪甲苷能濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞

24、肥大，以及TRPC6蛋白表達(dá)下調(diào)和鈣離子內(nèi)流減少。
　　6.黃芪甲苷能濃度依賴性地抑制高糖環(huán)境下人腎小球系膜細(xì)胞中的ROS生成、NADPH氧化酶活化、Nox4亞基的表達(dá)、Akt蛋白磷酸化以及 IκBα蛋白磷酸化和降解，從而發(fā)揮對(duì)系膜細(xì)胞中高糖活化的NADPH氧化酶/ ROS/ Akt/NF-κB信號(hào)通路的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.高糖能誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞的異常增殖和肥大，并顯著抑制系膜細(xì)胞TRPC6蛋白的表達(dá)和

25、鈣離子內(nèi)流，從而損傷系膜細(xì)胞活力和收縮功能。高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞損傷的作用可能是通過調(diào)節(jié)NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的，在該信號(hào)通路中，NADPH氧化酶性ROS生成與Akt信號(hào)活化可能是相互平行或相互交叉作用，并共同存在于NF-κB信號(hào)的上游。
　　2.黃芪甲苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞異常增殖和肥大以及 TRPC6蛋白下調(diào)和鈣離子內(nèi)流減少具有有效的抑制作用，從而保護(hù)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞的活力和收縮功能。