JNK-MAPK信號(hào)通路與NADPH氧化酶在氟致小膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 氟是機(jī)體生命活動(dòng)所必需的微量元素之一，但人體對(duì)氟的生理需要量很小，長(zhǎng)期攝入過(guò)量的氟會(huì)引起氟中毒。氟中毒不僅會(huì)造成機(jī)體牙齒、骨骼等硬組織的廣泛損傷，還可引起全身軟組織不同程度的廣泛損傷。近年來(lái)，一些現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，氟中毒病區(qū)兒童智力水平明顯下降，氟對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷受到關(guān)注，但其作用機(jī)制尚不清楚。
　　 目前氟的毒作用機(jī)制尚未完全明確，但由于腦組織中富含多不飽和脂肪酸，易受脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化作用被

2、普遍認(rèn)為是氟的毒作用機(jī)制之一。
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia, MG）廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervoussystem，CNS)，約占膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的10％～20％，在神經(jīng)元的生理活動(dòng)中起著支持、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)及修護(hù)等重要功能。MG一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，但對(duì)任何很小的中樞病理變化均可產(chǎn)生反應(yīng)而激活，激活的MG對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生有益的保護(hù)作用，如分泌生長(zhǎng)因子、吞噬膠質(zhì)細(xì)胞碎片、抵御外來(lái)抗原的侵襲等。但MG的過(guò)度激活可產(chǎn)生

3、大量細(xì)胞因子及活性氧產(chǎn)物，其異常激活及其所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是多種環(huán)境因素所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要因素。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)作為重要的第二信使參與調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinases，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，同時(shí)，MAPK信號(hào)通路活化后，又可經(jīng)過(guò)幾種激酶的活化產(chǎn)生更大量的ROS，促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生。因此，本研究以MG為切入點(diǎn)，探討氟是否可誘導(dǎo)小

4、膠質(zhì)細(xì)胞活化及其所致氧化損傷情況，了解MAPK通路在氟致小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激中是否起作用，探索氟致中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化損傷的機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 （一）細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞系(BV-2)購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％胎牛血清），5％ CO2、37℃條件下培養(yǎng)。
　　 （二）細(xì)胞增殖活力檢測(cè)
　　 采用MTT比

5、色法。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和6個(gè)染氟組，每組設(shè)置三個(gè)平行樣。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度(OD)值，細(xì)胞活力用還原率表示。還原率越高，表示細(xì)胞增殖活力越強(qiáng)。
　　 （三）IBA-1的細(xì)胞熒光免疫化學(xué)檢測(cè)
　　 采用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)方法，用熒光顯微鏡(×400)觀察BV-2細(xì)胞活化后特異性標(biāo)志物IBA-1的表達(dá)情況。細(xì)胞胞漿呈紅色為陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、染氟組。
　　 （四）細(xì)胞內(nèi)ROS、O2·-的檢測(cè)
　　

6、采用2’，7’-二乙酰二氯熒光素(DCFH-DA)法，用FACScan流式細(xì)胞儀于488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)弱用來(lái)代表ROS的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組和不加染料DCFH-DA的對(duì)照組，即2個(gè)對(duì)照組和染氟組。
　　 采用DHE法，用FACScan流式細(xì)胞儀于300nm激發(fā)波長(zhǎng)，610nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)弱用來(lái)代表O2·-的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組和不加染料DHE的對(duì)照組，即2個(gè)對(duì)照組和染氟組。

7、
　　 使用NADPH氧化酶抑制劑API或者JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞，之后加入NaF處理24 h，檢測(cè)ROS、O2·-的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組，50 mg/LNaF組，50+API(50+SP600125)組。
　　 （五）細(xì)胞內(nèi)NO的檢測(cè)
　　 采用DAF-FM DA法，用FACScan流式細(xì)胞儀于495nm激發(fā)波長(zhǎng)，515 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)弱用來(lái)代表NO的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照

8、組和不加染料DAF-FM DA的對(duì)照組，即2個(gè)對(duì)照組和染氟組。
　　 使用iNOS抑制劑SMT預(yù)處理細(xì)胞，之后加入NaF處理24 h，檢測(cè)NO的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組，50 mg/L NaF組，50+SMT組。
　　 （六）蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路
　　 采用蛋白免疫印跡法對(duì)MAPK信號(hào)通路的主要蛋白激酶進(jìn)行檢測(cè)。
　　 （七）ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α和IL-1β

9、　　 采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1β含量。實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組和染氟組。
　　 二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性分析。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，用Levene Statistic進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett T3檢驗(yàn);相關(guān)分析用PearsonCorrelation或非

10、參數(shù)相關(guān)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、氟處理的BV-2細(xì)胞增殖活力變化
　　 用濃度為0、1、5、10、25、50、100mg/L的NaF，分別處理BV-2細(xì)胞6、12、24、48和72 h后，細(xì)胞增殖活力隨著染氟濃度的增加而逐漸降低。但BV-2細(xì)胞染毒6h后，在1、5 mg/L NaF處理組，細(xì)胞增殖活力出現(xiàn)一個(gè)顯著升高現(xiàn)象(P＜0.05)。
　　 2、氟化鈉對(duì)BV-2

11、細(xì)胞的活化作用
　　 分別用1、5、10、50、100mg/L的NaF染毒BV-2細(xì)胞24 h后，采用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)方法，觀察BV-2細(xì)胞活化后特異性標(biāo)志物IBA-1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，1-100 mg/L NaF染毒組處理24 h后，細(xì)胞胞漿中紅色I(xiàn)BA-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
　　 3、氟暴露對(duì)BV-2細(xì)胞釋放炎性因子的影響
　　 BV-2細(xì)胞染毒12、24 h后，細(xì)胞內(nèi)的NO含量隨著氟暴露劑量增加顯著升高

12、。BV-2細(xì)胞染毒12h后，50、100 mg/L NaF處理組細(xì)胞內(nèi)NO含量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);BV-2細(xì)胞染毒24 h后，100 mg/L NaF處理組細(xì)胞內(nèi)NO含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 BV-2細(xì)胞染毒12h后，50、100 mg/L NaF處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);BV-2細(xì)胞染毒24 h后，10

13、0 mg/LNaF處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 BV-2細(xì)胞染毒12、24 h后，1 mg/L NaF處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、氟暴露對(duì)BV-2細(xì)胞氧化損傷的影響
　　 BV-2細(xì)胞染毒3、6、12、24 h后，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量隨著氟暴露劑量增加顯著升高。BV-2細(xì)胞染毒12、24 h

14、后，細(xì)胞內(nèi)的O2·-含量隨著氟暴露劑量增加顯著升高。
　　 5、NADPH氧化酶(NOX)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)在氟暴露引起的BV-2細(xì)胞氧化損傷中的作用
　　 與單獨(dú)染氟組相比，NOX抑制劑API能夠顯著降低NaF誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS、O2·-含量;與單獨(dú)染氟組相比，iNOS抑制劑SMT能夠顯著降低NaF誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)NO含量（P＜0.01）。
　　 6、MAPK信號(hào)通路在氟暴露引起的BV

15、-2細(xì)胞氧化損傷中的作用
　　 NaF能夠引起B(yǎng)V-2細(xì)胞JNK蛋白磷酸化水平升高，抗氧化劑褪黑素能夠部分降低氟引起的JNK磷酸化水平。JNK抑制劑能夠顯著降低氟暴露誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)O2·-、NO含量（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1、一定劑量的氟能夠引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化；
　　 2、氟可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高；
　　 3、JNK信號(hào)通路在氟引起的小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激中起作用；