JNK-MAPK信號通路在氯化鎘致小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　(1)利用體外原代培養(yǎng)的細(xì)胞，研究鎘對星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用；
　　(2)探討JNK/MAPK信號通路是否參與了鎘誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡過程。
　　方法:
　　(1)小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)：取新生24h內(nèi)（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠大腦皮質(zhì)，體外培養(yǎng)至9～14天，采用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，

2、GFAP）免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞；
　　(2)以0、5、10、20、40μmol/L鎘染毒0、3、6、9、12、24h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；采用c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）特異性抑制劑SP600125（終濃度50μ mol/L）預(yù)處理細(xì)胞45min，給予鎘染毒0、3、6、9、12、24h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；
　　(3)以0、5、10、20、

3、40μmol/L鎘染毒9、12h，MTT法測定氯化鎘對星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用；Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；
　　(4)以0、5、10、20、40μmol/L鎘染毒9、12h，Western blot檢測JNK磷酸化水平；以0、10、20μmol/L鎘染毒0、3、6、9、12h，Western blot檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK磷酸化水平；采用JNK特異性抑制劑SP600125(50μmol/L)預(yù)處

4、理細(xì)胞45min，給予鎘染毒9、12h，Western blot檢測JNK磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　(1)體外原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，呈多角形，錐形等，胞體大，胞突豐富；胞核圓形或卵圓形，偏于一側(cè)。培養(yǎng)至9～14天，經(jīng)GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽性細(xì)胞胞漿和突起呈棕黃色，陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)95％，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　(2)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化：鎘濃度為0～5μmol/L，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變；10μm

5、ol/L，隨染毒時(shí)間延長，細(xì)胞突起變細(xì)變短，細(xì)胞間隙開始增大；20μmol/L，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體回縮、突起消失或成毛刺狀，細(xì)胞間隙進(jìn)一步增大，細(xì)胞稀疏，部分細(xì)胞收縮成球形、壞死，脫落漂浮于培養(yǎng)基內(nèi)；40μmol/L時(shí)，細(xì)胞收縮成球形，壞死，細(xì)胞脫壁漂浮于培養(yǎng)液中。SP600125預(yù)處理45min，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化：0～10μmol/L,細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變；20μmol/L，細(xì)胞形態(tài)與單獨(dú)染鎘組比較，僅部分細(xì)胞突起變細(xì)變短

6、、胞體回縮；40μmol/L，細(xì)胞形態(tài)與單獨(dú)染鎘組比較，細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)連接仍存在，細(xì)胞胞體收縮呈球形，但未脫壁；
　　(3)MTT法檢測結(jié)果顯示，氯化鎘對原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定細(xì)胞毒性作用：鎘濃度為0μmol/L，染毒9、12h均未引起細(xì)胞存活率下降；鎘濃度為5～40μmol/L，染毒9、12h細(xì)胞存活率均明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：0、5

7、、10、20、40μmol/L鎘作用9h，細(xì)胞凋亡率分別為（7.40±0.50）%、（9.60±0.20）%、（11.50±1.00）%、（21.70±1.10）%、（3.80±0.40）%；作用12h，細(xì)胞凋亡率分別為（6.90±0.30）%、（11.50±1.50）%、（13.00±1.50）%、（16.80±1.00）%、（0.30±0.05）%；5～20μmol/L鎘濃度時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨染毒劑量增加而增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；至40μmol/L，隨著作用時(shí)間延長，壞死細(xì)胞數(shù)增加，分別為（53.40±0.25）%、（96.10±0.15）%；(4)Western blot檢測結(jié)果：10～40μmol/L鎘處理9、12h，JNK磷酸化水平增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；10、20μmol/L鎘染毒0～12h，JNK磷酸化水平增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SP600125預(yù)處理細(xì)胞，JNK磷酸化

9、水平降低，與單獨(dú)染鎘組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　(1)體外成功原代培養(yǎng)小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　(2)氯化鎘對原代培養(yǎng)小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的毒性作用，可抑制細(xì)胞生長；并誘導(dǎo)原代培養(yǎng)小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及壞死。
　　(3)JNK/MAPK信號通路參與了鎘誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡過程，JNK信號通路特異性抑制劑SP600125對鎘誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡有一定的保護(hù)作