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1、術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction, POCD)是病人術(shù)后出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要并發(fā)癥之一,主要以老年或危重病人高發(fā)。高齡和危重手術(shù)是被認(rèn)為是 POCD高危因素。然迄今為止,POCD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。中樞炎癥反應(yīng)是多種退行性疾病的主要特征,包括多發(fā)性硬化,阿爾茲海病,帕金森氏病,POCD等。隨著患者年齡的增長(zhǎng)或外周的刺激,老年病人或危重患者中樞處于輕度的慢性炎癥微環(huán)境。手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)
2、致中樞神經(jīng)炎癥免疫動(dòng)態(tài)失衡。一定的手術(shù)創(chuàng)傷刺激可激發(fā)中樞神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞活化,維持中樞炎癥免疫平衡,從而保護(hù)神經(jīng)元;但對(duì)老年患者或危重患者,一定手術(shù)創(chuàng)傷可激發(fā)外周和中樞炎癥免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng),大量釋放炎癥介質(zhì),發(fā)展成為持續(xù)性的炎癥反應(yīng),致中樞炎癥免疫動(dòng)態(tài)失衡,產(chǎn)生如 POCD一系列并發(fā)癥。星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最為廣泛的膠質(zhì)細(xì)胞,參與血腦屏障的組成,可直接收到來(lái)自外周免疫細(xì)胞和炎癥因子激活;同時(shí)也是
3、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性細(xì)胞因子和趨化因子的重要來(lái)源。IL-17A可介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在1993年證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá) IL-17RA受體。發(fā)現(xiàn)IL-17A對(duì)CNS的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有深刻的影響,特別是在缺血,炎癥和退行性變疾病。目前已經(jīng)證實(shí) IL-17RA在人類(lèi)和鼠類(lèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)。Act1/IRF-1信號(hào)通路在中樞炎癥免疫反應(yīng)起著重要作用,參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。由此,我們提出假說(shuō):在POCD中,手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的外源性的IL-17
4、A作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的IL-17RA,通過(guò)Act1/IRF-1信號(hào)通路調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、釋放炎癥因子和趨化因子,形成過(guò)度的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致POCD的形成。
第一部分:IL-17A對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響
目的:觀(guān)察IL-17A在TFS后的表達(dá)變化和和給予IL-17A抗體(Abs)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響和術(shù)后認(rèn)知的影響;
方法:建立小鼠TFS模型,模擬手術(shù)環(huán)境,觀(guān)察IL-17A在POCD中的表
5、達(dá)變化,給予Abs對(duì)中樞炎癥、星形膠質(zhì)細(xì)胞和術(shù)后認(rèn)知的影響;通過(guò)離體實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞,觀(guān)察不同濃度的IL-17A對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化的影響。采用ELISA測(cè)量血清,海馬組織IL-17A值;采用TFC(場(chǎng)景條件恐懼記憶實(shí)驗(yàn))和Y-maze(Y型迷宮)測(cè)試認(rèn)知功能改變;RT-qPCR測(cè)量炎癥因子(Il6, Tnfα,Il1β),趨化因子(Ccl2, Ccl5,Cxcl10)和Gfap基因的表達(dá);免疫組化監(jiān)測(cè)星形膠質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞在CA1和C
6、A3區(qū)的表達(dá);免疫熒光和Western Blotting監(jiān)測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
結(jié)果:ELISA顯示血清和海馬組織IL-17A在TFS后6h,12h,24h,48h時(shí)顯著增加;并于TFS后12h達(dá)到高峰,一直持續(xù)至術(shù)后48h;單純手術(shù)小鼠的CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加,星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化;海馬區(qū)炎癥因子(Il6, Tnfα,Il1β),趨化因子(Ccl2, Ccl5,Cxcl10)和Gfap基因表達(dá)顯著增加;T
7、FC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著減少和Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著增加;給予Abs后,CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化減少;顯著的降低海馬區(qū)炎癥因子(Il6, Tnfα,Il1β),趨化因子(Ccl2, Ccl5,Cxcl10)和Gfap基因表達(dá)減低;小鼠的CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞減少;TFC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著減低和 Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著提高。離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn) IL-17A劑量的增加,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化
8、顯著增強(qiáng),呈量效關(guān)系。
結(jié)論:手術(shù)可導(dǎo)致IL-17A分泌顯著增加,激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,激活中樞炎癥反應(yīng),導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙;給予Abs,可顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞活性,抑制中樞炎癥反應(yīng),改善術(shù)后認(rèn)知。
第二部分:IL-17A通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控術(shù)后認(rèn)知功能
目的:觀(guān)察IL-17A是否通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控術(shù)后認(rèn)知功能。
方法:通過(guò)培育GFAPTK F1小鼠,給予工具藥GCV和外源性IL-17A,鑒定GC
9、V是否完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞;均采用GFAPTK F1小鼠,隨即分為四組:Control組,GCV組,IL-17A組和GCV+IL-17A組,后三組均建立TFS模型。ELISA法測(cè)定血清IL-17A值;采用TFC和Y-maze測(cè)試認(rèn)知功能改變;免疫熒光確認(rèn)GFAPTK+GCV是否完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞;監(jiān)測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
結(jié)果:GFAPTK小鼠給予GCV后完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化;外源性IL-17A顯著的激活星形膠質(zhì)細(xì)胞
10、;血清IL-17A濃度增加;TFC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著減少和Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著增加;通過(guò)GCV完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞后,雖外源性IL-17A增加;但TFC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著增加和Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著減少。
結(jié)論:外源性IL-17A可顯著的激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞后, IL-17A并不能增加中樞炎癥反應(yīng);因此,IL-17A首先作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞,調(diào)控炎癥反應(yīng),影響認(rèn)知。
第三部分:IL
11、-17A介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Act1/IRF-1通路導(dǎo)致POCD發(fā)生
目的:IL-17A是否介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Act1/IRF-1通路導(dǎo)致POCD發(fā)生
方法:通過(guò)上述兩部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用Western Blotting法測(cè)定第一部分各組海馬組織Act1,TRAF6,NF-κB(p65)和IRF-1蛋白;免疫熒光法測(cè)第二部分各組海馬組織Act1和PSD95的表達(dá);
結(jié)果:手術(shù)后,海馬組織Act1,TRAF6,N
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