柴胡皂苷a對(duì)IL-1β激活大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)及機(jī)制研究.pdf

1、一、目的與意義： 癲癇是一組反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)元異常放電所致的短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的慢性疾病。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查表明癲癇的患病率為4.6‰。 傳統(tǒng)抗癲癇藥如苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平、乙琥胺等一直是治療癲癇的主要藥物，但藥代動(dòng)力學(xué)的局限性，致畸的可能性，對(duì)骨密度的影響，以及對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生的不良作用而導(dǎo)致癲癇患者生活質(zhì)量下降等因素，限制了其應(yīng)用。大約30％癲癇病人對(duì)各種療法包括藥物、癲癇手術(shù)、迷走神經(jīng)刺激等耐受，這就需要

2、研發(fā)新的抗癲癇藥物。中藥可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)控離子通道、抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、清除自由基等實(shí)現(xiàn)抗癲癇作用，而單味中藥的活性成分研究不但能明確抗癲癇機(jī)制，還有利于促進(jìn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化。 細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能與代謝，IL-1β能夠通過(guò)兩種途徑增強(qiáng)谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性：增強(qiáng)細(xì)胞外谷氨酸濃度，增強(qiáng)NMDA受體功能。IL-1β通過(guò)激活NF-KB和MAPK依賴性的基因引起長(zhǎng)期效應(yīng)，包括神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能改變。

3、星形膠質(zhì)細(xì)胞可參與神經(jīng)活動(dòng)的主動(dòng)控制和神經(jīng)突觸傳遞過(guò)程。癲癇發(fā)作激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，引起反應(yīng)性膠質(zhì)增生，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖、肥大，一些骨架蛋白如星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白及星形膠質(zhì)共同標(biāo)記一波形蛋白表達(dá)上調(diào)。體外研究證實(shí)MAPK介導(dǎo)細(xì)胞因子對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)。JNK/SAPK信號(hào)通路可被細(xì)胞因子、應(yīng)激刺激、生長(zhǎng)因子及某些G蛋白偶聯(lián)的受體激活。 柴胡皂苷a為我國(guó)傳統(tǒng)中藥柴胡中主要藥理成分柴胡皂苷的一種單體成分，我們前期的

4、研究發(fā)現(xiàn)柴胡總皂苷和SSa可以抗實(shí)驗(yàn)性癲癇、抑制慢性點(diǎn)燃大鼠GFAP的表達(dá)；影響戊四氮點(diǎn)燃大鼠海馬CA1區(qū)的Glu表達(dá)水平。本研究觀察了SSa對(duì)炎性因子IL-1β激活的體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)及其機(jī)制研究。 二、方法與內(nèi)容： 1.大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)參考McCarthy法加以改進(jìn)。取新生SD大鼠海馬，剪碎，消化，離心，差速貼壁40min后，按106個(gè)/ml接種。37.

5、0℃，5％Co2孵箱中培養(yǎng)7-9d，待培養(yǎng)的細(xì)胞70％-80％融合時(shí)，將培養(yǎng)瓶置于恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上搖18h(37.0℃，240r/min)后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)即得純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，純化的細(xì)胞進(jìn)一步運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法進(jìn)行鑒定。 2.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響 2.1活細(xì)胞數(shù)目與OD值線性檢驗(yàn)：純化的細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，用15％完全培養(yǎng)基按8×104個(gè)/ml的密度傳代，分別取10μl、25μ

6、l、50μl、75μl、150μl接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔以完全培養(yǎng)基補(bǔ)至200μl，每個(gè)劑量設(shè)4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，MTT測(cè)OD值。 2.2實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞傳代按7×104個(gè)/ml的密度用15％完全培養(yǎng)基接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔種植200μl。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對(duì)照組，IL-1β15ng/ml的激活組，IL-1β15ng/ml+SSa劑量組，每組設(shè)6孔。用含5％胎牛血清的培養(yǎng)基配制不同藥物，每孔加入200

7、μl，干預(yù)72h后，MTT法測(cè)OD值。 3.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞分裂周期的影響 運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期。將傳代細(xì)胞以5×105個(gè)/ml密度種植于75cm2的培養(yǎng)瓶中。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，DMEM/F12無(wú)血清養(yǎng)培養(yǎng)基血清剝奪24h，細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組，IL-1β15ng/ml的激活組，IL-1β15ng/ml+SSa不同劑量組。用DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基配制不

8、同藥物，加藥刺激24h后終止作用，細(xì)胞用預(yù)冷的70％乙醇固定，PI染色并調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/ml，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期，每組樣本檢測(cè)104個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞指數(shù)表示分布于細(xì)胞周期各時(shí)相的細(xì)胞百分比數(shù)，以增殖指數(shù)反映細(xì)胞增殖狀態(tài)。 4.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、vimentin、p-JNK、NF-KB表達(dá)的影響 運(yùn)用Western-blot法分別檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、

9、vimentin、p-JNK、NF-KB表達(dá)量。傳代細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的密度種植于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48h后，DMEM/F12無(wú)血清養(yǎng)培養(yǎng)基血清剝奪24h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組，IL-1β15ng/ml的激活組，IL-1β15ng/ml+SSa不同劑量組。用DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基配制不同藥物，加藥刺激24h后終止作用，全蛋白提取試劑盒提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量以確定上樣量，運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)GFA

10、P、vimentin、p-JNK、NF-KB表達(dá)的變化，對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度分析，計(jì)算不同蛋白與β-actin的比值。每組蛋白檢測(cè)6次。 5.統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以X±S表示，各組MTT比色法結(jié)果和western-blot檢測(cè)結(jié)果比較采用單因素方差分析，多重比較用LSD法：活細(xì)胞數(shù)目與OD值線性檢驗(yàn)采用CurveEstimation；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異

11、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、結(jié)果： 1.大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定 原代培養(yǎng)的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，鏡下觀察可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)較好，所有細(xì)胞均貼壁，可見(jiàn)光暈，胞突明顯，細(xì)胞向外伸出長(zhǎng)短不一的突起，細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)一清晰的卵圓形的細(xì)胞核，胞質(zhì)豐富。原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定，細(xì)胞GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性率為95％以上。 2.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

12、經(jīng)CurveEstimation統(tǒng)計(jì)分析，活細(xì)胞數(shù)目與MTT法所測(cè)OD值成線性，RSquare=0.997，P<0.001。 SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響：含IL-1β的激活組的OD值高于對(duì)照組且有顯著性差異，說(shuō)明IL-1β對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有促增殖的激活作用。SSa各劑量組OD值均低于激活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SSa可抑制IL-1β激活下星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常增殖。SSa2mg/L組OD值顯著性低于對(duì)照

13、組，SSa0.5mg/L組顯著性高于對(duì)照組，而SSa1mg/L組和對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞分裂周期的影響 各組流式細(xì)胞結(jié)果顯示：各組細(xì)胞的增殖指數(shù)有顯著性差異，IL-1β激活組的增殖指數(shù)較control組高，說(shuō)明IL-1β對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有促增殖的激活作用。SSa各劑量組增殖指數(shù)均低于激活組，說(shuō)明各劑量組對(duì)激活的細(xì)胞的分裂周期均有一定的阻滯作用。其中SSa1mg/L的增殖指數(shù)

14、較其他組低與對(duì)照組最接近，說(shuō)明此劑量組對(duì)激活膠質(zhì)細(xì)胞分裂周期的阻滯作用較其他組強(qiáng)。 4.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組的GFAP光密度值較對(duì)照組增加1.5倍，且有顯著性差異，說(shuō)明IL-1β激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP表達(dá)量顯著增加。SSa各組的光密度值較激活組顯著降低，SSa1，0.5mg/L可使星形膠質(zhì)細(xì)

15、胞GFAP表達(dá)分別下降34.7％和53.2％。SSa1mg/L給藥組光密度值與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞vimentin表達(dá)的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組的光密度值較對(duì)照組增加1.2倍，且有顯著性差異，說(shuō)明IL-1β激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)vimentin顯著增加。SSa各組的光密度值較激活組顯著降低，SSa1，0.5

16、mg/L可使星形膠質(zhì)細(xì)胞vimcntin表達(dá)量分別下降17.6％和23.8％。SSa1mg/L給藥組光密度值與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。 6.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞p-JNK表達(dá)的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組的p-JNK光密度值較對(duì)照組增加1.1倍，且有顯著性差異。SSa1，0.5mg/L兩組的光密度值較激活組顯著降低，分別下降7.7％和8.6％。

17、與對(duì)照組比較，SSa1mg/L給藥組光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 7.SSa對(duì)IL-1β激活的大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-KB表達(dá)的影響 Westernblot條帶光密度分析顯示含IL-1β15ng/ml的激活組NF-KB光密度值較對(duì)照組增加1.5倍，且有顯著性差異。SSa各組的光密度值較激活組顯著降低，可使星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)下降。 四、結(jié)論： 1.SSa能夠抑制IL-1β激活引起的“反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞