ROS、NF-κB介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷及黃芪甲苷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:探索黃芪甲苷對(duì)3，4苯并芘(Benzo(a) pyrene，BaP)介導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells)損傷是否有保護(hù)作用，并且研究其可能的機(jī)制，為以后的藥物干預(yù)提供思路。
　　方法:
　?。ㄒ唬┨剿鼽S芪甲苷對(duì)EPCs的功能的影響:采集健康順產(chǎn)產(chǎn)婦(37-39w)臍帶血，用密度梯度離心法以及貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)。然后用Dil標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(Dil-ac

2、-LDL)攝取實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的荊豆凝集素(FITC-UEA-1 lectin)結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)來鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為內(nèi)皮祖細(xì)胞。用胰酶消化收集第四代內(nèi)皮祖細(xì)胞，并且進(jìn)行隨機(jī)分組:1.培養(yǎng)基組(Control組):沒有任何干預(yù);2.溶劑組（DMSO組）:添加培養(yǎng)基及DMSO溶劑，DMSO濃度為1mL·L-1;3.損傷組（BaP組）:添加培養(yǎng)基及用DMSO溶解的BaP，BaP濃度為20μ M;4.黃芪甲苷各

3、組:黃芪甲苷的濃度分別為2，10 and50μ g/mL，并且每組都添加濃度為20μM的BaP，在加入BaP之前先用不同濃度的黃芪甲苷預(yù)處理2h，再繼續(xù)培養(yǎng)24h。最后用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力，用Transwel小室檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力，用細(xì)胞粘附能力檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附能力。
　?。ǘ┛赡艿臋C(jī)制研究:用胰酶消化收集第四代內(nèi)皮祖細(xì)胞，并進(jìn)行隨機(jī)分組:1.培養(yǎng)基組(Control組):沒有任何干預(yù);2.

4、溶劑組（DMSO組）:添加培養(yǎng)基及DMSO溶劑，DMSO濃度為1mL· L-1;3.損傷組(BaP組):添加培養(yǎng)基及用DMSO溶解的BaP，BaP濃度為20μM;4.黃芪甲苷各組:黃芪甲苷的濃度分別為2，10and50μ g/mL，并且每組都添加濃度為20μM的BaP，在加入BaP之前先用不同濃度的黃芪甲苷預(yù)處理2h，再繼續(xù)培養(yǎng)24h。最后采集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用SOD試劑盒和MDA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液的SOD及MDA表達(dá)含量。用RO

5、S試劑盒對(duì)各組內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)行免疫熒光染色，并且分析各組EPCs的ROS表達(dá)量。最后用免疫印跡法檢測(cè)各組EPCs細(xì)胞核中NF-κ B的含量。
　　結(jié)果:
　　（一）EPCs的培養(yǎng)及鑒定:通過密度梯度離心法分離培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞，集落呈現(xiàn)典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)Dil標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）攝取和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素（FITC-UEA-1 lectin）結(jié)合雙染實(shí)驗(yàn)以及Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)鑒定，

6、結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)特異性抗原，為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　?。ǘ┹^培養(yǎng)基組相比，BaP明顯損害了的EPCs的增殖、粘附、遷移能力(P＜0.01)， ROS及MDA表達(dá)含量明顯升高(P＜0.01)，SOD含量明顯減少(P＜0.01)，NF-κ B的表達(dá)量明顯上升(P＜0.05)。相反，較BaP組相比，各組黃芪甲苷組的EPCs的增殖、粘附、遷移能力得到大幅度改善(P＜0.05)， SOS及MDA表達(dá)含量明顯降低(P＜0.05)，SOD含量明