腦腫瘤干細(xì)胞致病機(jī)制的研究.pdf

1、腦腫瘤是致死率最高的人類腫瘤之一，其中IV級膠質(zhì)瘤膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）為成人最常見的原發(fā)性腦腫瘤，其患者的中位生存期僅有15個月左右。膠質(zhì)膜細(xì)胞瘤呈現(xiàn)浸潤性生長，可向正常腦組織廣泛浸潤，導(dǎo)致手術(shù)切除困難。其次，GBM對常規(guī)的放、化療具有抵抗性，成為其致死率高和復(fù)發(fā)率高的重要原因。由于尚未完全闡明其發(fā)病機(jī)制，目前缺乏針對GBM的有效治療方法。近年來，腫瘤干細(xì)胞的理論指出，膠質(zhì)瘤中有一部分細(xì)胞

2、具有極強(qiáng)的致瘤特性，且具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，是GBM生長和復(fù)發(fā)的根源，稱之為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（gliomastemcell，GSC）。另外，GSCs還對放、化療具有抵抗性，因而也是GBM復(fù)發(fā)的根源。
　　我們的研究包括了GSC的分離培養(yǎng)、GSC標(biāo)志物的探索，以及探討影響GSC致瘤性和干細(xì)胞特征的分子機(jī)制。
　　第一部分：采用手術(shù)切除的新鮮組織，利用神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcell,NSC）培養(yǎng)基——無血清培養(yǎng)基（serumf

3、reemedium,SFM）——培養(yǎng)出富含GSC的神經(jīng)球。本課題分離培養(yǎng)了17例原發(fā)性腦腫瘤，其中7例形成了神經(jīng)球樣細(xì)胞系，并可傳至5-20代。在此基礎(chǔ)上，我們研究了神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物CD15標(biāo)記GSC的情況。目前研究GSC的一個關(guān)鍵難題是尚缺乏特異性的GSC標(biāo)記物。CD133（PROM1）是最早采用的GSC標(biāo)記物，研究指出CD133+的膠質(zhì)瘤細(xì)胞富含有GSC。然而近期的研究指出也有部分的GSC呈現(xiàn)CD133-。因而，進(jìn)一步尋找GSC的標(biāo)

4、記物即成為研究GSC的重要課題。分析GSC的特點(diǎn)我們得出，GSC具有正常NSCs的特點(diǎn)，且目前的證據(jù)指出GBM起源于NSC。因而，我們提出假說，指出NSC的一些標(biāo)記物也可用于標(biāo)記GSC。CD15（SSEA-1/LeX）是常用的NSC標(biāo)記物，我們此部分的目的即是探討CD15是否可成為GSC的標(biāo)記物。我們首先采用免疫組織化學(xué)的方法研究了CD15在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。結(jié)果指出CD15廣泛表達(dá)于膠質(zhì)瘤，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、II和III級

5、星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及室管膜細(xì)胞瘤。其次我們采用免疫磁珠分選出CD15+的細(xì)胞，并比較了CD15+細(xì)胞和CD15-細(xì)胞的干細(xì)胞特性，發(fā)現(xiàn)，CD15+細(xì)胞較CD15-細(xì)胞具有更強(qiáng)的神經(jīng)球形成能力。將分選的細(xì)胞移植入裸鼠腦內(nèi)后，104的CD15+細(xì)胞即可形成腫瘤而同樣數(shù)目的CD15-細(xì)胞則不能形成腫瘤。免疫組化研究指出CD15+細(xì)胞形成的移植瘤與原發(fā)性的腫瘤具有相似的免疫組織特性。進(jìn)一步，我們分選出CD133-CD15+細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD133-C

6、D15+細(xì)胞也具有GSC特性，即具有形成神經(jīng)球以及在免疫缺陷小鼠腦內(nèi)形成腫瘤的能力，進(jìn)一步證明CD15可標(biāo)記出部分CD133-的GSC。同一時間發(fā)表的另一篇文章得到了與我們相似的結(jié)論（CellStemCell.2009May8;4(5):440-52）。
　　第二部分：癌基因ZNF217對GSC分化的影響。由于GSC對膠質(zhì)瘤的致瘤性具有重要作用，因而針對GSC的治療成為具有希望的治療靶點(diǎn)。目前研究認(rèn)為，通過促進(jìn)GSC分化可抑制膠質(zhì)

7、瘤的生長，因而研究調(diào)節(jié)GSC干細(xì)胞特性以及分化的內(nèi)在機(jī)制成為研究的一個重要方向。目前對控制GSC分化的分子機(jī)制尚知之甚少。本部分研究了新的癌基因ZNF217（鋅指蛋白217）對GSC分化的影響。ZNF217在多種腫瘤中高表達(dá)，且具有抑制干細(xì)胞分化的作用。然而ZNF217在膠質(zhì)瘤的研究尚未見報道。采用實(shí)時定量PCR（quantitativeRT-PCR，qPCR）結(jié)果指出ZNF217在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著高于正常腦組織，且在GBM中的表達(dá)顯

8、著高于低級別膠質(zhì)瘤（p<0.001）。對一個分子數(shù)據(jù)庫的分析指出，膠質(zhì)瘤中ZNF217的表達(dá)水平與患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)，因而是潛在的治療靶點(diǎn)。其次，ZNF217在GSC中的表達(dá)高于正常NSC以及非GSCs（non-GSCs），且在血清培養(yǎng)集中誘導(dǎo)分化后ZNF217的表達(dá)降低。這些結(jié)果表明，ZNF217在GSC中的特異性高表達(dá)，因而可能對GSC的維持具有重要作用。采用siRNA沉默GSC中ZNF217表達(dá)可抑制GSC的生長并促進(jìn)GSC向成熟的

9、細(xì)胞分化。因而ZNF217在GBM中高表達(dá)對GSC的生長以及維持具有重要的作用。GSC在膠質(zhì)瘤中處于一個特殊的缺氧微環(huán)境中。研究指出缺氧可增加GSC的致瘤性并增加干細(xì)胞的比例。因而，我們進(jìn)一步探討ZNF217是否也參與了缺氧調(diào)控的GSC致瘤性。采用GSC細(xì)胞系和常規(guī)的U87細(xì)胞系，我們研究指出在缺氧環(huán)境下ZNF217表達(dá)上調(diào)。由于缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxiainducilblefacors,HIFs）是缺氧環(huán)境下發(fā)揮作用的重要因子，我們

10、進(jìn)一步探討了ZNF217是否受到HIFs的調(diào)控。利用qPCR對GBM標(biāo)本的mRNA檢測指出ZNF217表達(dá)與HIF1αα以及HIF2α呈正相關(guān)（p<0.01）。采用siRNA沉默U87和GSC中HIF1α或者HIF2α的表達(dá)，會顯著降低ZNF217的表達(dá)水平，且HIF1α或者HIF2α沉默后ZNF217在缺氧環(huán)境中的上調(diào)也受到了抑制。因而ZNF217在缺氧環(huán)境中的表達(dá)上調(diào)受到HIFs的調(diào)控。
　　第三部分：干細(xì)胞因子LIN28對G

11、SC發(fā)生的影響。本部分課題在約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院CharlesC.Eberhart實(shí)驗(yàn)室完成。LIN28可抑制Let-7microRNA，后者可抑制K-ras、C-myc、HMGA2等癌基因。LIN28在多種癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)的腫瘤分化較差、患者預(yù)后較差。免疫組織化學(xué)結(jié)果指出LIN28在部分膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，而在正常腦組織中未檢測到。采用慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默GSC細(xì)胞系JHH-GBM1中的LIN28后，MTT和軟瓊脂克隆試驗(yàn)結(jié)果

12、指出沉默LIN28可顯著抑制其生長以及克隆形成能力。其次，將LIN28在另一GBM細(xì)胞系JHH-GBM14中過表達(dá)可增加其侵襲性以及體內(nèi)形成腫瘤的能力。因而LIN28對GSC的生長具有重要作用。為進(jìn)一步探討GSC的發(fā)生機(jī)制，我們分析了LIN28在GSC形成中的作用。我們采用了人源性的腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞（NSC-Ctx），然后利用慢病毒使其表達(dá)GBM中常見的癌基因，包括組成性活性K-RAS（constitutivelyactivatedKR

13、AS，CA-KRAS），無活性的p53（dominantnegativeR248Wp53，DN-p53），hTERT以及LIN28（NSC-KRAS/p53/hTERT/LIN28）。作為對照我們同時構(gòu)建了NSC-GFP，NSC-p53/hTERT以及NSC-p53/hTERT/LIN28。值得注意的是我們試圖構(gòu)建的NSC-p53/hTERT/KRAS細(xì)胞無法存活，表明LIN28在NSC表達(dá)這些基因的過程這起著重要作用。體外實(shí)驗(yàn)表明NS

14、C-KRAS/p53/hTERT/LIN28較正常NSC具有更強(qiáng)的增殖特性。體內(nèi)結(jié)果表明，將NSC-KRAS/p53/hTERT/LIN28注射入裸鼠腦內(nèi)4-5周即可長出腫瘤，且生長的移植瘤呈現(xiàn)膠質(zhì)瘤的免疫組織特性，表達(dá)Nestin、GFAP、Ki67但不表達(dá)synaptophysin。而對照組NSC-GFP、NSC-p53/hTERT以及NSC-p53/hTERT/LIN28在移植入裸鼠腦內(nèi)6個月后均無腫瘤形成。采用shRNA沉默NS

15、C-KRAS/p53/hTERT/LIN28中的LIN28之后細(xì)胞無法繼續(xù)存活。這些結(jié)果表明LIN28對NSC向膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化中起著重要作用。
　　總結(jié)：我們成功分離并鑒定出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，且鑒定出新的GSC標(biāo)志物CD15。在此基礎(chǔ)上，我們探索出ZNF217是調(diào)控GSC干細(xì)胞和致瘤性的重要癌基因，且其表達(dá)受到缺氧環(huán)境的影響。最后在探討GSC發(fā)生機(jī)制的研究中，我們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞因子LIN28對膠質(zhì)瘤的形成具有重要作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步