microRNA參與腦腫瘤干細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells)是存在于腫瘤中的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞和腫瘤不斷擴大的源泉。到目前為止，人們已成功的從造血系統(tǒng)惡性腫瘤、乳腺癌和腦腫瘤患者組織中分離并培養(yǎng)出各自的腫瘤干細(xì)胞。這證明在腫瘤細(xì)胞群體中確實存在一類極少數(shù)的能使群體擴增的腫瘤干細(xì)胞。
　　 腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)化的特性，即由一個克隆來源的腫瘤細(xì)胞在生長過

2、程中，形成在侵襲能力、生長速度、分化程度、對激素的反應(yīng)、對抗癌藥物的敏感性等方面有所不同的亞克隆。腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的現(xiàn)象只有用腫瘤干細(xì)胞的理論才能解釋，即腫瘤干細(xì)胞在不同選擇壓力下，向不同功能方向分化、成熟，造成腫瘤細(xì)胞的群體漂移，從而形成異質(zhì)性。因此，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤的根源，消滅了腫瘤干細(xì)胞就意味著消滅了腫瘤。長期以來，人們發(fā)現(xiàn)實體瘤的缺氧程度與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。傳統(tǒng)的腫瘤化療主要針對迅速增殖的瘤細(xì)胞，TSC在細(xì)胞群中增殖緩慢，對化療

3、不敏感，TSC的膜表面蛋白受HIFs的調(diào)控，在低氧環(huán)境中能高效地排除藥物，保護TSC不被殺滅，其對通過減少腫瘤細(xì)胞負(fù)載的治療方法有抗性，而TSC在缺氧的環(huán)境中也能得到更好的保護。缺氧的細(xì)胞對放療也不敏感，低氧是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的普遍特征，研究表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞放射抗性歸結(jié)于細(xì)胞DNA修復(fù)能力的增強，提示在缺氧狀態(tài)下，癌癥干細(xì)胞的輻射抗性會顯著提高。因此不論是化療或是放療，缺氧都是腫瘤治療的重要靶點。
　　 miRNA在腫瘤發(fā)生、

4、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用，相關(guān)領(lǐng)域的研究已取得很多成果，為miRNA在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但miRNA在腫瘤中表達(dá)失調(diào)的機制等問題仍需要進(jìn)一步研究。隨著研究的深入，miRNA與腫瘤的關(guān)系必將得以闡明，miRNA在腫瘤防治中的應(yīng)用也必將會有更廣闊的前景，成為腫瘤治療的新策略。
　　 本研究應(yīng)用miRNA芯片從miRNA水平分析U87腫瘤干細(xì)胞缺氧后的改變，發(fā)現(xiàn)U87腫瘤干細(xì)胞缺氧后特異表達(dá)的miRNA。通過合成特

5、異miRNAmimic(miRNA寡核苷酸模擬物)，轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87腫瘤干細(xì)胞。運用細(xì)胞和分子生物學(xué)實驗對其進(jìn)行功能研究，為腦膠質(zhì)瘤提供發(fā)病機制提供新的思路，也為腦膠質(zhì)瘤的分子診斷和miRNA治療奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1.將U87細(xì)胞接種于含B27、肝素、表皮生長因子、堿性成纖維生長因子的無FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待U87細(xì)胞增殖形成細(xì)胞球3～4d

6、后，吸取上清培養(yǎng)液（含細(xì)胞球），重新吹打成單細(xì)胞懸液，按1:2或1:3比例傳代。原代細(xì)胞球形成并達(dá)到100～200個細(xì)胞后，收集其細(xì)胞球，以2％多聚甲醛固定，室溫15min;10％驢血清封閉10min，加入鼠抗人CD133—抗，4℃孵育過夜;加入Cy3標(biāo)記的兔抗小鼠二抗，室溫孵育2h，Hoechst33342染核。在顯微鏡下隨機選擇20個高倍視野進(jìn)行陽性CSCs計數(shù)。缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)使用缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、

7、1％O2。應(yīng)用microRNA芯片芯片系統(tǒng)研究U87腫瘤干細(xì)胞具有缺氧相關(guān)的miRNAs。
　　 2.以缺氧與正常的U87腫瘤干細(xì)胞的總RNA為模版，使用兩部法熒光定量PCR方法，擴增目的基因，同時設(shè)U6rRNA為內(nèi)參。反應(yīng)結(jié)束后，以U6rRNA為內(nèi)標(biāo)，采用2-△△Ct方法來計算每種miRNA在的相對定量值。
　　 3.取對數(shù)生長期U87腫瘤干細(xì)胞，計數(shù)，無抗生素培養(yǎng)基重懸，按6孔板每孔接種3×105細(xì)胞，加培養(yǎng)基至2m

8、l，培養(yǎng)16-24h后轉(zhuǎn)染。合成特異miRNAmimic(miRNA寡核苷酸模擬物)，轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87腫瘤干細(xì)胞，RT-PCR檢測hsa-let-7i表達(dá)量，WesternBlot檢測轉(zhuǎn)染U87腫瘤干細(xì)胞Bcl-2、Caspase3、Caspase9蛋白的表達(dá)，TUNEL檢測轉(zhuǎn)染hsa-let-7mimicU87腫瘤干細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測miRNAmimics誘導(dǎo)凋亡。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.應(yīng)用mic

9、roRNA芯片芯片系統(tǒng)研究U87腫瘤干細(xì)胞具有缺氧相關(guān)的miRNAs。
　　 經(jīng)Hy3熒光標(biāo)記、純化，進(jìn)行芯片雜交，圖像采集，數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，以兩種細(xì)胞Hy3熒光標(biāo)記信號強度的比值≤0.5或≥2為標(biāo)準(zhǔn)判定差異表達(dá)miRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組U87腫瘤干細(xì)胞相比，處理組的U87腫瘤干細(xì)胞中，上調(diào)表達(dá)的miRNA有10個，下調(diào)表達(dá)的miRNA有13個。處理組與對照組U87MG比較，細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)的miRNAs為hsa-let

10、-7i、hsa-miR-29c、sv40-miR-S1-5p、hsa-miR-1290、hsa-miR-584、hsa-miR-625*、hsa-miR-1914、hsa-miRPlus-G1246-3p、hsa-miR-4279、hsv2-miR-H7-3p、hsa-miR-3679-3p、hsa-miR-3675-3p、hsa-miR-1246，上調(diào)表達(dá)的miRNAs是hsa-miR-143、hsa-miR-124、hsa-miR-

11、15a、hsa-miR-144、hsa-miR-9*、hsa-miR-33b、hsa-miR-24-1*、hsvl-miR-H4*、hsa-miR-4297、hsa-miR-3613-3p，其中hsa-let-7i、hsa-miR-143等多個有文獻(xiàn)報道與細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)。
　　 2.qRT-PCR方法對芯片結(jié)果進(jìn)行檢測
　　 使用Agilent2100生物分析儀鑒定從干細(xì)胞中提取總RNA的質(zhì)量，分別測定

12、28S/18S峰值面積都在2:1左右，RNA的質(zhì)量符合熒光定量分析的要求。選取4種miRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)結(jié)束后，以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法來計算每種miRNA的在處理前后的相對定量值。hsa-miR-124上調(diào)10.82±1.17hsa-miR-143上調(diào)4.82±0.20hsa-let-7i下調(diào)2.04±0.08hsa-miR-29c下調(diào)1.96±0.01與芯片結(jié)果基本相同（芯片結(jié)果:hsa-miR-124上調(diào)

13、11.79441663倍，hsa-miR-143上調(diào)4.748774253倍,hsa-let-7i下調(diào)2.087019倍,hsa-miR-29c下調(diào)2.0929982倍）
　　 3.hsa-let-7imimics對U87腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)影響
　　 QRT-PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染hsa-let-7imimics的U87腫瘤干細(xì)胞的hsa-let-7i的表達(dá)水平升高。流式細(xì)胞儀檢測hsa-let-7imimic轉(zhuǎn)染U87腫瘤

14、干細(xì)胞48小時后能誘導(dǎo)U87腫瘤干細(xì)胞的凋亡，各組間差異顯著(F=464.229，P=0.000)，且各處理組與對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示:Bcl-2的蛋白水平降低達(dá)，Caspase3，Caspase9蛋白水平增強。Tunel檢測顯示DNA斷裂的凋亡細(xì)胞標(biāo)記有增強的熒光。說明轉(zhuǎn)染hsa-let-7imimics可以誘導(dǎo)U87腫瘤干細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 應(yīng)用micr