外燥小鼠模型的建立與評(píng)價(jià).pdf

1、中醫(yī)證候動(dòng)物模型是在中醫(yī)學(xué)整體觀念及辨證施治思想指導(dǎo)下，運(yùn)用臟象學(xué)說和病因病機(jī)理論，把人類疾病原型的某些特征在動(dòng)物身上模擬復(fù)制，是中醫(yī)學(xué)人體證候的具體再現(xiàn)，是開展中醫(yī)證候及中藥藥理研究和新藥開發(fā)的一個(gè)重要途徑。
　　 燥，為自然界六氣之一，是秋之主氣?！皻q金太過”或“歲木不及”，則燥氣可化為致病因素，稱為燥邪，因其來源于外，故常稱為外燥。外燥是中醫(yī)病因?qū)W說的重要組成部分，但對(duì)外燥理論與實(shí)驗(yàn)的研究均較少。本課題在前期研究的基礎(chǔ)之上

2、，擬通過總結(jié)中醫(yī)動(dòng)物模型以及中醫(yī)證候動(dòng)物模型的研究方法，結(jié)合外燥的病機(jī)特點(diǎn)，探討建立外燥動(dòng)物模型的途徑，并通過實(shí)驗(yàn)研究觀察外燥動(dòng)物模型的病理變化規(guī)律，對(duì)外燥動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，為建立穩(wěn)定的、可靠的、可重復(fù)的外燥小鼠動(dòng)物模型提供依據(jù)。
　　 一、理論研究:
　　 (一)外燥小鼠模型造模因素的選擇中醫(yī)動(dòng)物模型復(fù)制的諸多方法雖然各自有顯著的優(yōu)點(diǎn)，但是均有明顯的不足之處。課題組在導(dǎo)師張六通教授的指導(dǎo)下，回顧了半個(gè)世紀(jì)以來中醫(yī)證候動(dòng)

3、物模型的研究歷程，認(rèn)為中醫(yī)證候動(dòng)物模型的研究應(yīng)該從三個(gè)方面出發(fā)：優(yōu)化動(dòng)物模型的造模因素；建立規(guī)范的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法；選擇具有特征性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。外燥動(dòng)物模型應(yīng)該在外燥相關(guān)理論的指導(dǎo)下，復(fù)制符合外燥病機(jī)和證候的動(dòng)物模型。
　　 外燥的流行責(zé)之于“歲金太過”或“歲木不及”，其產(chǎn)生原因與我國(guó)的地理結(jié)構(gòu)和氣候特點(diǎn)相關(guān)，我國(guó)的氣候存在濕→干轉(zhuǎn)換時(shí)間短于干→濕轉(zhuǎn)換時(shí)間的特征，所以秋之燥氣容易化為燥邪。模擬秋季氣候變化的方法建立外燥小鼠模型，既

4、可較好地體現(xiàn)外燥的變化規(guī)律，也可避免以極端干燥地區(qū)濕度條件為基礎(chǔ)的研究結(jié)果對(duì)動(dòng)物模型穩(wěn)定性和可重復(fù)性的影響。
　　 (二)外燥小鼠模型評(píng)價(jià)方法的探討
　　 外燥的病理變化有兩個(gè)主要特點(diǎn)：燥性干澀，易傷津液；燥易傷肺，影響肺的宣發(fā)肅降功能，可見口鼻干燥，咽干口渴，干咳少痰，或痰液膠黏難咯等癥狀。
　　 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)衛(wèi)氣的防御作用與肺部免疫效應(yīng)密切相關(guān)，研究顯示衛(wèi)氣的運(yùn)行節(jié)律與免疫節(jié)律高度一致，并且衛(wèi)氣虛的患者IgG

5、，IgA，IgE的含量有明顯變化。外燥動(dòng)物模型支氣管肺泡灌洗液中IgA、IgG和SP-A含量的變化可以較全面地反映呼吸道不同部位免疫能力的改變，可以反映外燥動(dòng)物模型肺氣衛(wèi)外功能變化的規(guī)律。
　　 氣道粘膜由細(xì)胞層和粘液層組成
　　 氣道粘液層有兩部分：凝膠層和溶膠層。氣道粘液層的變化，可在一定程度上反映吸入空氣對(duì)氣道津液代謝影響的規(guī)律。氣道Muc5ac mRNA及其蛋白的表達(dá)可在一定程度上反映氣道凝膠層的變化，而氣道AQ

6、P5 mRNA及其蛋白的表達(dá)可提示氣道溶膠層的變化，通過觀察氣道Muc5ac和AQP5 mRNA及其蛋白表達(dá)的變化可揭示肺津液代謝的規(guī)律。
　　 二、實(shí)驗(yàn)研究:
　　 (一)動(dòng)物及分組
　　 SPF級(jí)BALB/c小鼠70只，體重18±1g，雌雄各半。由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-2005。
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組(C組)、溫燥模型Ⅰ組

7、(WⅠ組)、溫燥模型Ⅱ組(WⅡ組)、常燥模型Ⅰ組(QⅠ組)、常燥模型Ⅱ組(QⅡ組)、涼燥模型Ⅰ組(LⅠ組)、涼燥模型Ⅱ組(LⅡ組)，置人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行造模。C、WⅠ、QⅠ、LⅠ組小鼠于第7日上午，WⅡ、QⅡ、LⅡ組小鼠于第13日上午按實(shí)驗(yàn)要求取材，取材前4小時(shí)禁水禁食。
　　 (二)指標(biāo)檢測(cè);
　　 1.小鼠一般情況觀察觀察小鼠的神態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛色澤及有無脫落，飲食狀況及糞便物理性狀變化。
　　 2.小鼠肺組

8、織結(jié)構(gòu)觀察采用蘇木素伊紅(HE)染色法。
　　 3.支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IgG、IgA和SP-A蛋白含量的檢測(cè)。采用定量ELISA試劑盒檢測(cè)。
　　 4.肺組織Muc5ac mRNA和AQP5 mRNA表達(dá)的測(cè)定采用SYBR GreenⅠ熒光嵌合法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)。
　　 5.肺組織Muc5ac蛋白表達(dá)的測(cè)定采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)。
　　 6.肺組織AQP5蛋白表達(dá)的測(cè)定，采用蛋白

9、免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)。
　　 (三)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　
　　 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間兩兩比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、結(jié)果:
　　 本課題外燥小鼠模型的復(fù)制條件，既體現(xiàn)了秋季氣候變化的過程，又體現(xiàn)了秋季氣候變化的特征，較好地體現(xiàn)外燥的致病特點(diǎn)。

10、>　　 “邪之所湊，其氣必虛”(《素問·評(píng)熱病論》)，外燥導(dǎo)致各組外燥小鼠模型的正氣受到不同程度的損傷，尤其是肺氣的宣發(fā)功能。肺氣的宣發(fā)功能改變主要表現(xiàn)為肺氣衛(wèi)外和肺氣宣發(fā)津液兩方面外燥小鼠模型BALF中IgA、IgG和SP-A含量的變化體現(xiàn)了肺氣衛(wèi)外功能的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與IgG含量的變化不同，雖然溫燥、涼燥和常溫燥小鼠模型BALF中IgA、SP-A含量的變化存在一定的差異，但是各組IgA、SP-A含量變化的趨勢(shì)是一致的。

11、>　　 外燥小鼠模型氣道AQP5 mRNA及其蛋白表達(dá)的下降，提示外燥導(dǎo)致氣道內(nèi)津液含量下降，同時(shí)也導(dǎo)致了津液不能外達(dá)氣道。而氣道Muc5ac mRNA及其蛋白表達(dá)的增加，可能是一種保護(hù)性反應(yīng)，以防止氣道水液進(jìn)一步的散失，也可能是外燥導(dǎo)致的一種病理變化。Muc5ac表達(dá)增加所反映的凝膠層的增厚與AQP5表達(dá)降低所代表的溶膠層的變薄，均可降低氣道粘膜纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)率，導(dǎo)致氣道防御能力下降，即肺氣衛(wèi)外能力降低。外燥小鼠模型出現(xiàn)毛色枯燥、飲水量

12、增加，糞便略顯干燥等癥狀，也是外燥之“燥勝則干”的表現(xiàn)。
　　 咳嗽的發(fā)生一方面是由于氣道內(nèi)痰液的刺激，另一方面也可能由氣道反應(yīng)性增強(qiáng)所致。外燥小鼠模型氣道AQP5的降低和Muc5ac表達(dá)的增加，不僅可導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增加，而且可導(dǎo)致了氣道粘膜纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)率的下降，使氣道內(nèi)痰液形成成為可能，并且提示形成的痰液性質(zhì)較為粘稠。
　　 綜上所述，外燥小鼠模型不僅體現(xiàn)了外燥形成的病機(jī)，而且具有外燥的基本癥狀和體征，是研究外燥發(fā)病機(jī)理較

13、好的平臺(tái)。
　　 四、結(jié)論:
　　 本課題成功地建立了外燥小鼠模型，該模型接近人類外感燥邪的發(fā)病機(jī)制，較好地體現(xiàn)了外燥導(dǎo)致肺氣輸布津液的功能下降，體內(nèi)津液不能外達(dá)，體表津液無以為繼而發(fā)生干燥的病機(jī)，并且可以推斷模型存在外燥之干咳少痰，或痰液膠黏難咯等癥狀。
　　 1.外燥小鼠模型的造模因素模擬早秋，中秋和晚秋氣候特點(diǎn)建立外燥小鼠模型的條件如下：早秋(溫燥)：溫度22士2℃，相對(duì)濕度33士2％；中秋(常燥)：溫度1

14、5℃士2℃，相對(duì)濕度33士2％；晚秋(涼燥)：溫度8士2℃，相對(duì)濕度33士2％；人工外燥環(huán)境風(fēng)速設(shè)定為2.5m/s。
　　 2.外燥小鼠模型的評(píng)價(jià)
　　 (1)外燥小鼠模型毛色枯燥，偶見聳毛、蜷縮等現(xiàn)象，飲水量有所增加，糞便略顯干燥。
　　 (2)外燥小鼠模型氣道粘膜皺襞增多，杯狀細(xì)胞增生明顯，氣道粘液厚度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　 (3)外燥小鼠模型氣道BALF中IgA含量增加，SP-A的含量增加。