模擬HBeAg陰性HBV感染的小鼠模型的建立.pdf

1、背景與目的：盡管已有有效的疫苗，但是，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus HBV)感染仍然是一個(gè)主要的健康問題。全球大約有2.48億的乙肝病毒慢性感染者。乙肝病毒有兩種常見表型，30年前，HBeAg（HBVe antigen HBeAg）陽性的野生型病毒株為主要的流行株，近幾年，HBeAg陰性HBV病毒株的感染呈上升趨勢。HBeAg陽性和陰性兩種類型的慢性感染者在流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)理、自然病程、預(yù)后及治療等方面都有很大的不同

2、。HBeAg陰性患者對抗病毒治療相比HBeAg陽性病人持續(xù)應(yīng)答率低，治療時(shí)間長,發(fā)展成肝癌的風(fēng)險(xiǎn)更大。因此,開展HBeAg陰性HBV發(fā)病機(jī)制及其治療藥物的研究具有很重要的意義。實(shí)驗(yàn)動物模型在疾病發(fā)病機(jī)理及藥物研發(fā)中具有重要作用。目前，很少有關(guān)于 HBV HBeAg陰性模型的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立一個(gè)能模擬 HBeAg陰性HBV持續(xù)感染的小鼠模型。
　　方法：
　　1.分析53例HBV病人HBsAg及HBeAg的攜帶狀況，

3、通過SNaPshot進(jìn)行病毒基因型的鑒定。
　　2.以臨床病人血清為模板，通過 PCR擴(kuò)增HBeAg陰性 HBV全長基因，通過分子生物學(xué)方法將全長基因克隆至pEASY-Blunt Simple載體，構(gòu)建pEASY-HBeAg-negative HBV質(zhì)粒，測序鑒定；測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對分析。
　　3.用BspQI酶切pEASY-HBeAg-negative HBV質(zhì)粒，膠回收線狀目的片段，然后通過T4DNA連接

4、酶過夜連接，使其在體外環(huán)化成共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA(covalently closed circμlar cccDNA)，對環(huán)化產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI及PSAD酶切鑒定及測序鑒定。
　　4.通過流體動力學(xué)的方法將cccDNA及pAAV/HBV1.2質(zhì)粒通過尾靜脈分別注射到C57BL/6J小鼠中，注射后，分別于第1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w通過小鼠尾靜脈采集血清樣本；于第3w和10w經(jīng)麻醉后頸椎

5、脫臼處死，然后取肝組織。
　　5.通過放射免疫法在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)檢測病毒血清特異性標(biāo)志HBsAg和HBeAg的表達(dá)；通過免疫組織化學(xué)的方法檢測肝臟組織中HBsAg及HBcAg的表達(dá)；蘇木素-伊紅（HE）染色及酶聯(lián)免疫反應(yīng)觀察肝臟的病理變化及血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性變化；利用熒光定量的方法檢測血清及肝臟中HBV DNA拷貝數(shù)，并利用滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合PCR的方法檢測肝臟中cccDNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.53例HBV感染患者中

6、，27名HBV陽性的患者HBeAg檢測為陰性，占感染總?cè)藬?shù)的50.9％； HBVA基因型感染者1例，B基因型38例，C型感染者14例。
　　2.克隆基因與GenBank中JX661478.1號HBV基因序列可達(dá)98%的同源性；基因的4個(gè)開放讀碼框完整，基礎(chǔ)核心啟動子區(qū)（BCP）存在A1762T，G1764A的雙突變，減少了HBeAg的表達(dá)；前C區(qū)存在G1896A的突變，提前終止HBeAg的表達(dá)。
　　3.測序及酶切驗(yàn)證都顯示

7、，線性DNA被環(huán)化為cccDNA，沒有堿基的缺失及外源基因的插入。
　　4.在注射HBeAg陰性cccDNA的小鼠中，注射5周內(nèi)，HBV感染率達(dá)到100％；HBsAg水平迅速升高，并在第一周時(shí)達(dá)到峰值，隨后迅速下降；60％的 cccDNA注射小鼠，HBsAg和HBcAg可持續(xù)表達(dá)超過10周；所有小鼠，HBeAg陰性；血清和肝臟中HBV DNA含量可分別達(dá)107拷貝/ml和108拷貝/ml；肝臟組織中可檢測到cccDNA的表達(dá)。pA