適宜于HBV感染的新型細胞模型的研究.pdf

1、研究背景: 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是嗜肝DNA病毒屬的一員。HBV可以引起肝臟的急、慢性感染，HBV的慢性感染是引起嚴重肝臟疾?。ū热纾焊斡不⒏渭毎伟┑闹饕∫?。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球20多億人曾感染乙肝病毒，其中3.5億以上為慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎不易徹底治愈，并且具有發(fā)展成肝硬化、肝癌的高度危險性。每年全世界范圍內(nèi)約有一百萬人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝衰竭、肝硬化和

2、肝細胞肝癌。我國約有超過50％的居民曾被乙肝病毒感染過，其中8％～15％的人成為慢性感染者。 自從1965年Blumberg等發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原，到1997年乙肝病毒全基因組的克隆和測序完成，人們對HBV的基因組成、抗原結(jié)構(gòu)、生物學特性及其生命周期的認識迅速發(fā)展。但是由于嗜肝DNA病毒屬的感染具有嚴格的宿主特異性和組織特異性，限制了適合于研究人HBV感染的體外細胞模型的建立。 目前，用于體外研究HBV的細胞模型主要

3、是人原代肝細胞和肝癌細胞來源的細胞系。人原代肝細胞用于HBV感染研究有其特有的優(yōu)勢：人原代肝細胞保留了分化肝細胞的重要細胞學特性，允許HBV的自然穿入和完整復制。然而，其缺陷在于在體外培養(yǎng)幾天后，原代肝細胞開始出現(xiàn)肝細胞特殊形態(tài)的消失，并且失去了對HBV的感染和復制能力。此外，人原代肝細胞必須由新鮮肝臟組織獲得，來源有限，并且其對病毒的攝取能力還受到細胞生長狀態(tài)的影響。人原代肝細胞培養(yǎng)因為存在上述困難而限制了其應用，對HBV的研究更多的

4、依賴于轉(zhuǎn)染了HBV DNA克隆的分化良好的肝癌細胞系。其中最常用的是HepG2.2.15細胞系，HepG2.2.15細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了完整的HBV基因組，表達HBV RNA、病毒蛋白并能產(chǎn)生病毒樣顆粒。由HepG2.2.15細胞分泌的病毒顆粒已經(jīng)被證實可以感染黑猩猩。目前我們對于HBV復制和病毒基因組組成的許多重要的知識都是通過對轉(zhuǎn)染了HBV DNA的肝癌細胞系的研究獲得的。但是，由于HBV基因組是通過轉(zhuǎn)染而非自然感染的方式進入到細胞中的，

5、這些轉(zhuǎn)染了HBV DNA的肝癌細胞系不能用于對HBV感染宿主細胞的早期感染過程的研究，包括病毒吸附，穿入和脫殼等過程。 由于缺乏有效的體外病毒感染和復制模型系統(tǒng)，HBV感染肝臟的早期機制研究進展較為緩慢，從而在一定程度上影響了乙型肝炎及其相關(guān)肝臟疾病的基礎和臨床研究。本研究旨在建立一個適合于HBV自然感染，并能有效進行病毒復制的細胞模型，為HBV感染宿主細胞的早期機制，以及病毒侵入人肝細胞后完整的復制過程的研究提供一個有用的研究

6、工具。 具體實驗內(nèi)容如下： 第一部分雜交細胞株HepCHLine-4的建立 目的: 建立人原代肝細胞與HepG2的雜交細胞，以作為后續(xù)實驗研究的基礎。 方法: 1.建立人原代肝細胞與HepG2的雜交細胞。 1.1利用化學誘變劑誘導HepG2細胞產(chǎn)生次黃嘌呤烏嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）基因突變。 1.2人原代肝細胞的分離與培養(yǎng)，臺盼藍染色排除法確定肝細胞存活率。

7、 1.3利用細胞融合技術(shù)，將篩選出的HGPRT缺陷的HepG2細胞（HGPRT-HepG2細胞）與人原代肝細胞進行融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選出異核體雜交細胞，進而用有限稀釋法進行單克隆。 1.4利用胰蛋白酶G顯帶技術(shù)對所得細胞進行核型分析。 1.5繪制雜交細胞生長曲線。 2.對雜交細胞是否攜帶HBV基因進行檢測。 因為本研究中融合成功的雜交細胞是用慢性乙型肝炎攜帶者的肝細胞與HepG2細胞融合所得，所以在進

8、行HBV感染實驗之前我們對雜交細胞是否攜帶HBV基因進行檢測。 2.1合成HBV型特異性引物，用巢式PCR檢測雜交細胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中是否存在HBVDNA。 2.2提取雜交細胞基因組DNA，綠豆核酸酶消化后，巢式PCR檢測雜交細胞內(nèi)是否存在HBV的復制中間產(chǎn)物HBV cccDNA。 2.3雜交細胞是否表達HBV特異性蛋白抗原：間接免疫熒光檢測雜交細胞內(nèi)是否有HBcAg的表達；電化學發(fā)光法檢測雜交細胞培養(yǎng)上清中的HB

9、sAg和HBeAg。 結(jié)論: 1.成功建立了一個兼具有HepG2和人原代肝細胞遺傳特性的雜交細胞株HepCHLine-4，可以進一步用來研究建立適宜于HBV感染的細胞模型。 2.雜交細胞HepCHLine-4雖然是由慢性乙型肝炎攜帶者肝細胞與HepG2細胞融合所得，但是并不攜帶HBV基因及HBV的復制中間產(chǎn)物，故可以用于HBV感染的實驗研究。 第二部分評價雜交細胞株HepCHLine-4對HBV的自然感染

10、能力 目的: 用慢性乙型肝炎患者血清中的病毒顆粒自然感染雜交細胞，評價雜交細胞對HBV的自然感染能力，探討雜交細胞株HepCHLine-4用作HBV感染細胞模型的可能性。 方法: 1.用含HBV DNA的慢性乙型肝炎患者血清分別與雜交細胞HepCHLine-4和HepG2細胞共同孵育，感染細胞，HepG2細胞作為對照細胞。 2.用HBV型特異性引物，巢式PCR檢測感染后細胞HBV DNA合成及分泌

11、情況。 3.提取感染后細胞基因組DNA，綠豆核酸酶消化后，巢式PCR檢測感染后細胞內(nèi)有無HBV復制中間產(chǎn)物HBV cccDNA。 4.感染后雜交細胞中HBV特異性蛋白合成及分泌能力的檢測：間接免疫熒光檢測感染后細胞內(nèi)是否有HBcAg的表達；電化學發(fā)光法檢測感染后細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg。 5.電鏡檢查感染后細胞能否向培養(yǎng)上清中分泌HBV病毒顆粒。 結(jié)論: 雜交細胞HepCHLine-

12、4可以被慢性乙型肝炎患者血清中的HBV病毒自然感染，感染后病毒可以侵入雜交細胞并在雜交細胞內(nèi)進行病毒基因的復制，形成復制中間產(chǎn)物HBV cccDNA；并且進一步進行病毒基因的表達，合成HBV特異性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg：HBV感染后雜交細胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細胞。 到目前為止，經(jīng)過了一年多的凍存復蘇和傳代培養(yǎng)，雜交細胞HepCHLine-4已經(jīng)傳代50代次以上，細胞形態(tài)和生長特性沒有明顯改變，并且保持其對