新型HCV感染細(xì)胞模型及小鼠模型研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一,其慢性化及致癌率高,是嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。目前尚缺乏有效的HCV預(yù)防性疫苗,這進(jìn)一步增加了HCV的防控難度。HCV具有高度種屬特異性,僅能感染人和黑猩猩,不能自然感染小鼠,致使HCV感染性模型缺乏,嚴(yán)重阻礙了HCV復(fù)制及致病機(jī)制研究、抗病毒藥物及疫苗研制與評(píng)價(jià)等。建立新型HCV感染性細(xì)胞模型及小動(dòng)物模型,對(duì)HCV基礎(chǔ)及應(yīng)用

2、研究具有重要意義。本研究分別利用Tet-on可誘導(dǎo)系統(tǒng)和第三代腺病毒載體系統(tǒng),探索并建立了新型 HCV感染細(xì)胞模型及小鼠模型,以期為 HCV復(fù)制與致病機(jī)制研究、疫苗及抗病毒藥物評(píng)價(jià)等提供一個(gè)新的技術(shù)手段。
　　1.肝組織特異性可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究
　　(1)可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型的建立及鑒定
　　人肝嵌合小鼠模型是將人肝細(xì)胞異種移植到受體鼠肝內(nèi)建立的適合于嗜肝病毒體內(nèi)感染研究的小鼠模型,現(xiàn)有的Al

3、b-uPA/SCID轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型,由于在肝組織特異性白蛋白(Albumin)啟動(dòng)子作用下組成性表達(dá)小鼠尿激酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator, uPA)分子,造成出生小鼠肝損傷,為人肝細(xì)胞的移植及嵌合生長提供了微環(huán)境;但其嚴(yán)重不足之處是小鼠出生時(shí)死亡率高達(dá)70％～90%,使得該模型穩(wěn)定性差,繁育及操作難度大。因此,建立繁育和操作簡單、穩(wěn)定性好和死亡率低的模型是發(fā)展該模型的關(guān)鍵。

4、為了降低Alb-uPA/SCID小鼠出生時(shí)高死亡率,增強(qiáng)模型穩(wěn)定性,本研究采用Tet-on可誘導(dǎo)系統(tǒng)建立了一種可誘導(dǎo) uPA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人肝嵌合小鼠模型。首先,我們分別構(gòu)建了Tet-on-Albumin和TRE2-uPA轉(zhuǎn)基因載體,在體外證實(shí)了Albumin啟動(dòng)子具有體外轉(zhuǎn)錄活性,并且Dox可誘導(dǎo)活性u(píng)PA分子表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,我們分別制備了Tet-on-Albumin和TRE2-uPA兩種轉(zhuǎn)基因小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Albumin啟動(dòng)子也

5、具有體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性,可調(diào)控性rtTA蛋白在Tet-on-Albumin轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織特異性表達(dá)。研究結(jié)果顯示Dox可誘導(dǎo)uPA在Tet-on-Albumin/TRE2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織特異性表達(dá),且滲漏表達(dá)率極低, Tet-on-Albumin/TRE2-uPA/SCID小鼠經(jīng)Dox誘導(dǎo)后進(jìn)行了HepG2和Huh-7細(xì)胞脾內(nèi)移植。結(jié)果顯示,其有效嵌合度可達(dá)30%,小鼠死亡率低于5%。本研究成功建立了一種肝組織特異性可誘導(dǎo) uPA

6、轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并且以此為基礎(chǔ)建立了可誘導(dǎo)型uPA轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型,為進(jìn)一步開展HCV感染研究以及抗病毒藥物評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)可誘導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于HBV轉(zhuǎn)染及HCV感染研究
　　本研究將可誘導(dǎo)Tet-on-Albumin/TRE2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用于pAAV-HBV水動(dòng)力轉(zhuǎn)染模型研究。結(jié)果顯示,與 Dox未誘導(dǎo)小鼠相比,Dox誘導(dǎo)的Tet-on-Albumin/TRE2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)染

7、pAAV-HBV后,HBV基因組在小鼠體內(nèi)復(fù)制表達(dá)明顯增加,小鼠肝臟炎性損傷顯著加重,血清中白介素-6及腫瘤壞死因子α顯著升高(p<0.01),肝組織病理損傷加重,AFP基因轉(zhuǎn)錄水平升高。相比于C57BL/6小鼠,可誘導(dǎo)Tet-on-Albumin/TRE2-uPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠更適合HBV水動(dòng)力轉(zhuǎn)染模型的建立,其應(yīng)用于uPA與HBV病毒復(fù)制及致病機(jī)制研究具有更顯著的優(yōu)勢(shì)。此外,本研究以可誘導(dǎo) uPA轉(zhuǎn)基因人肝嵌合小鼠模型為基礎(chǔ),進(jìn)一步開

8、展了HCV陽性血清感染研究。通過尾靜脈接種HCV陽性血清后, HCV蛋白和RNA檢測(cè)為陰性。其原因可能是 HCV陽性血清感染滴度較低或小鼠種屬特異性等綜合因素所致,具體原因有待進(jìn)一步探索。相比于直接利用陽性血清接種感染,利用具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的載體介導(dǎo)HCV感染,其穩(wěn)定性和有效性或?qū)⑻岣??？烧T導(dǎo)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立,為進(jìn)一步開展HBV轉(zhuǎn)染及HCV感染研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.第三代腺病毒介導(dǎo)的HCV全基因組細(xì)胞模型及小鼠模型研究

9、
　　現(xiàn)有的人肝嵌合小鼠模型屬于免疫缺陷型小鼠,不能有效應(yīng)用于肝炎病毒感染致病、免疫感染機(jī)制及疫苗研究和評(píng)價(jià)等方面。因此,建立非免疫缺陷型(即正常免疫狀態(tài))的可用于HCV復(fù)制與致病機(jī)制研究、疫苗及抗病毒藥物評(píng)價(jià)的小鼠模型,已成為HCV模型研究新的重要方向。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或病毒載體介導(dǎo)病毒基因組建立相應(yīng)的動(dòng)物模型是值得探索研究的新的技術(shù)途徑。為了建立具有正常免疫狀態(tài)的 HCV小鼠模型,本研究采用輔助病毒依賴型腺病毒(HDAd, he

10、lper-dependent adenovirus)載體介導(dǎo)HCV全基因組,探索建立制模簡便而模型穩(wěn)定的HCV新型細(xì)胞模型和小鼠模型。HDAd是第三代腺病毒載體,又稱空殼載體,由于去除了腺病毒全部的編碼反式作用蛋白的基因(功能由輔助病毒提供),僅保留了兩端反向末端重復(fù)序列(ITRs, inverted terminal repeats)以及包裝信號(hào)(Ψ),因而其包裝容量高達(dá)37kb,可用于 HCV全基因組的包裝;而目前常用的其他病毒載體

11、因包裝容量限制,無法用于HCV約10kb全基因組的包裝及遞送。HDAd具有高滴度、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、低毒性以及肝組織嗜性等優(yōu)點(diǎn),也使其非常適合HCV全基因組呈遞。本研究首次利用HDAd包裝HCV全基因組,進(jìn)行 HCV全基因組細(xì)胞模型以及小鼠模型的建立和評(píng)價(jià)研究,以期為HCV復(fù)制與致病機(jī)制研究、疫苗及抗病毒藥物評(píng)價(jià)提供一個(gè)新的技術(shù)手段。
　　(1)第三代腺病毒介導(dǎo)的HCV全基因組細(xì)胞模型
　　雖然近年來,HCV感染性細(xì)胞模型取得一定

12、進(jìn)展,以Huh-7細(xì)胞及其衍生細(xì)胞系為基礎(chǔ),先后建立了HCV2a型JFH1全基因組體外轉(zhuǎn)錄RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型以及JFH1基因組cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型,以上兩種轉(zhuǎn)染模型均能支持HCV的有效復(fù)制及病毒產(chǎn)生,但轉(zhuǎn)染性細(xì)胞模型對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的狀態(tài)和轉(zhuǎn)染條件要求較高,其可重復(fù)性及穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。本研究采用HDAd介導(dǎo)HCV全基因組感染的一種新的技術(shù)途徑,探索建立操作簡便和模型穩(wěn)定的HCV感染細(xì)胞模型。首先在HCV2a型JFH1全基因組3’

13、加入一個(gè)HDV核酶位點(diǎn)后將其連入HDAd載體中,通過輔助病毒AdNG163實(shí)現(xiàn)重組HDAdJFH1病毒的包裝、擴(kuò)增及梯度離心純化,得到較高滴度的重組HDAdJFH1病毒,進(jìn)而建立HDAd介導(dǎo)的HCV全基因組細(xì)胞模型。細(xì)胞免疫熒光、Western blot及Northern blot結(jié)果顯示,HDAd介導(dǎo)了HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA在Huh-7細(xì)胞中的有效表達(dá)。實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)上清中HCV RNA水平最高可達(dá)

14、1.8×107拷貝/ml。另外,上清再感染的細(xì)胞免疫熒光、抗體阻斷以及透射電鏡和免疫電鏡結(jié)果均表明,細(xì)胞及培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了感染性HCV病毒顆粒。實(shí)驗(yàn)研究表明,通過HDAd介導(dǎo),我們建立了一種新型HCV感染性細(xì)胞模型,該模型可穩(wěn)定連續(xù)傳代,有效支持HCV復(fù)制及感染性HCV產(chǎn)生,HCV感染性滴度最高達(dá)1×103 ffu/ml。同時(shí)該細(xì)胞模型也可用于α干擾素等抗病毒藥物評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示, HDAd同樣能介導(dǎo)HCV1b型Con1全基因組感染

15、性細(xì)胞模型的建立。這對(duì)建立不同基因型的HCV細(xì)胞模型和進(jìn)行相關(guān)抗病毒藥物評(píng)價(jià)等具有重要意義。
　　(2)第三代腺病毒介導(dǎo)的HCV全基因組小鼠模型
　　HCV具有高度種屬特異性,僅能感染人和黑猩猩,不能自然感染小鼠,目前尚無法實(shí)現(xiàn)HCV在非免疫缺陷型小鼠體內(nèi)復(fù)制和感染。本研究通過HDAd介導(dǎo)HCV全基因組小鼠模型的建立,通過輔助病毒AdNG163實(shí)現(xiàn)重組HDAdJFH1病毒的包裝、擴(kuò)增,經(jīng)梯度離心純化后,HDAdJFH1病毒滴

16、度可達(dá)2×1011病毒顆粒數(shù)(viral particle, vp)/ml,將1×1010vp HDAdJFH1以及HDAdGFP病毒分別通過尾靜脈注射入C57BL/6小鼠體內(nèi)建立了由HDAd介導(dǎo)的HCV2a型JFH1全基因組小鼠模型。結(jié)果顯示該小鼠模型可支持HCV的表達(dá)和復(fù)制,肝組織中可檢測(cè)到HCV core、NS3蛋白以及HCV RNA,血清中HCV RNA水平可持續(xù)至感染后第8周。利用建立的HCV小鼠模型對(duì)抗-HCV藥物miR-1