豬附紅細(xì)胞體小鼠感染模型的建立及血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè).pdf

1、本研究對(duì)豬附紅細(xì)胞體(EH)的不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法、小鼠模型建立以及附紅細(xì)胞體感染小鼠后的血液學(xué)免疫學(xué)變化進(jìn)行了較深入的探討。 一、豬附紅細(xì)胞體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立 本研究采用了光學(xué)顯微鏡鏡檢(包括鮮血滴片鏡檢和瑞氏-姬姆薩染色鏡檢)、透射電鏡觀察以及PCR檢測(cè)方法檢測(cè)豬EH。鮮血滴片鏡檢和瑞氏-姬姆薩染色涂片均能清晰地觀察到EH的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但此兩種方法易產(chǎn)生假陽(yáng)性，需要透射電鏡檢測(cè)或者是PCR檢測(cè)作為輔助診斷。通過(guò)透射電

2、鏡可以觀察到EH的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)EH附著于紅細(xì)胞表面從而引起紅細(xì)胞內(nèi)陷，其結(jié)果可以作為診斷依據(jù)，但此法操作復(fù)雜，成本較高，不宜作為臨床普及使用。 本研究根據(jù)已有的豬EH特異性片段設(shè)計(jì)引物，成功地?cái)U(kuò)增得到810 bp的PCR產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)所建立的豬EH的PCR檢測(cè)方法具有高度的特異性和敏感性，可以用于豬附紅細(xì)胞體病的流行病學(xué)調(diào)查。同時(shí)，本研究初步建立了豬EH的SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法。根據(jù)已有的豬EH特異性片段設(shè)計(jì)

3、引物，通過(guò)條件的優(yōu)化，建立的方法簡(jiǎn)便快速，特異性高。 二、豬附紅細(xì)胞體小鼠感染模型的建立 本研究分別采用感染豬附紅細(xì)胞體病的豬全血和分離純化的豬EH作為感染源攻毒SPF昆明小鼠，感染后通過(guò)血液壓滴片鏡檢，PCR檢測(cè)及透射電鏡檢測(cè)鑒定模型建立成功。結(jié)果顯示采用分離純化的豬EH作為感染源的攻毒小鼠在感染后3 d左右感染率（感染附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞所占紅細(xì)胞總數(shù)的比率）達(dá)到了高峰，而后又下降。而采用感染豬EH的豬全血作為感染源的

4、攻毒小鼠一直維持一種低的感染狀態(tài)。表明采用分離純化的豬EH作為感染源可以取得更為良好的效果，此模型可用于附紅細(xì)胞體病致病機(jī)制和藥物篩選等方面的研究。 三、人工感染豬附紅細(xì)胞體對(duì)小鼠血液學(xué)及免疫學(xué)指標(biāo)的影響 在構(gòu)建豬EH小鼠感染模型的基礎(chǔ)上，研究了感染后血液常規(guī)指標(biāo)，RBC-IC花環(huán)率和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的變化，旨在為附紅細(xì)胞體病跨種間感染機(jī)制研究以及免疫功能變化研究提供借鑒。研究結(jié)果顯示小鼠感染EH后紅細(xì)胞總數(shù)減少，血紅

5、蛋白含量降低，紅細(xì)胞比容降低，RBC-IC花環(huán)率上升，其他指標(biāo)沒(méi)有顯著變化。提示EH感染可能并不能引起機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是可能對(duì)非特異的紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)有影響。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 通過(guò)本研究，建立了豬EH光鏡、透射電鏡及PCR檢測(cè)方法，并建立了EH的SPF小鼠感染模型，研究了EH感染對(duì)血液常規(guī)指標(biāo)，紅細(xì)胞免疫粘附功能以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響，初步探索了附紅細(xì)胞體病免疫致病機(jī)理，為防止附紅細(xì)胞體病的爆發(fā)流行提供了前期