豬附紅細胞體PCR檢測及體外培養(yǎng)方法的建立.pdf

1、附紅細胞體病(Eperythrozoonosis)是廣泛存在于人和動物體內的一種人畜共患病，己對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成巨大威脅。豬附紅細胞體病是由豬附紅細胞體附著在紅細胞上或者寄生于血漿中而引起。主要表現(xiàn)為急性型高熱、黃疸、貧血等癥狀；慢性感染引起動物生長緩慢和母豬的繁殖障礙。所以對該病的研究就顯得十分重要。本研究對豬附紅細胞體的病原形態(tài)、生物學特性以及體外培養(yǎng)方法進行了初步的探索，并建立了特異性強、敏感性高的PCR快速診斷方法。

2、　　 目前，學者對豬附紅細胞體的形態(tài)結構和生物學特性尚有很多爭議。為確定病原，本試驗采用鮮血壓片鏡檢，血液涂片染色鏡檢和掃描電鏡觀察等方法對該病原進行研究。觀察到的豬附紅細胞體以圓形和短桿狀為主；吉姆薩染色呈藍紫色，有折光性；掃描電鏡顯示寄生在紅細胞變形后的毛刺頂端，推測其可能是以出芽方式繁殖。這與其他學者的報道基本一致。
　　 根據(jù)GenBank上已報道的豬附紅細胞體16S rRNA的序列設計一對特異性引物，進行PCR擴增并

3、將產物克隆到T—vector后測序。結果表明擴增到的目的基因片段為404 bp，與GenBank上坳coplasma suis序列同源性為97％。試驗建立的PCR診斷方法特異性強，與健康豬血液、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、弓形蟲、豬圓環(huán)病毒DNA無交叉反應，能檢測出的最低DNA濃度是8.6fg/μl。PCR診斷方法的敏感性、特異性和診斷率均為100％，明顯優(yōu)于血液涂片染色鏡檢方法。應用該方法對浙江部分地區(qū)豬

4、附紅細胞體病進行流行病學調查顯示：檢測樣品80份，其中陽性8份，感染率為10％。該方法具有快速、準確、敏感等特點，適合于豬附紅細胞體病的早期診斷，同時也為豬附紅細胞體病分子流行病學的調查提供技術支撐。
　　 為建立簡單穩(wěn)定、成本低的豬附紅細胞體體外培養(yǎng)方法，本試驗在前人報道的方法基礎上加以改進。取96孔培養(yǎng)板每孔加入170μl完全培養(yǎng)液，25μl經PBS洗滌后備用的正常豬紅細胞泥和5μl感染附紅細胞體的紅細胞泥，使每孔的總體積保