水通道蛋白1介導(dǎo)的ROS轉(zhuǎn)運及自噬的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：AQP1是位于不同細(xì)胞的膜蛋白，控制水的流入以及細(xì)胞體積，其在不同的器官中參與各種生理功能以及病理變化的作用。AQPs尚能轉(zhuǎn)運其他小分子以及氣體，包括二氧化碳，氨，一氧化氮和過氧化氫。過氧化物(O2-)分子是活性氧(ROS)的重要組成部分，是線粒體ATP合成的副產(chǎn)品，越來越多的證據(jù)表明ROS是細(xì)胞損傷甚至死亡的重要原因，參與各種生理過程，顯然需要嚴(yán)格監(jiān)管ROS的水平。自噬是細(xì)胞在缺乏能量及氧氣等代謝條件下出現(xiàn)的生理過程，自噬可以將

2、ROS降解從而避免細(xì)胞進一步的損傷。所以如何調(diào)控自噬的發(fā)生、發(fā)展將對于我們治療疾病、維持身體機能有著重要意義。本實驗在探討碘乙酰胺(iodoacetamide，IA)通過導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生ATP轉(zhuǎn)運障礙進而誘導(dǎo)Balb/c3T3細(xì)胞ROS的生成而影響水通道蛋白1(AQP1)的表達的基礎(chǔ)上，進一步說明AQP1與ROS的關(guān)系。通過比較細(xì)胞內(nèi)ROS水平及自噬的變化進一步說明AQP1與自噬的關(guān)系。
　　方法：⑴應(yīng)用IA(30μmol/L)造成細(xì)

3、胞能量缺乏，作用于Balb/c3T3細(xì)胞0、4、6小時后，Western Blot檢測AQP1的表達以及自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ、自噬流的改變。⑵NAC(2.5mmol/L)拮抗上述實驗IA所造成的ROS的大量生成，DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平變化，同時Western Blot檢測AQP1的表達。⑶應(yīng)用AQP1特異裝載的慢病毒感染HUVEC細(xì)胞使細(xì)胞AQP1過表達，用Western blot驗證AQP1的表達。HUVEC細(xì)胞成功過表達

4、AQP1后加IA(30μmol/L)模擬細(xì)胞內(nèi)低氧環(huán)境，DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化同時觀察細(xì)胞功能變化。⑷用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲除Balb/c3T3細(xì)胞中的AQP1，應(yīng)用Western-Blot檢測AQP1轉(zhuǎn)染是否成功。應(yīng)用IA(30μmol/L)處理siRNA-AQP1轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞，Western-Blot檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ及自噬流的改變。
　　結(jié)果：①利用IA模擬線粒體低氧環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生，同時A

5、QP1的表達量也大量增加，與IA處理時間成正比，各時間組有顯著性差異(P＜0.05)。②利用抗氧化劑NAC拮抗IA模擬的低氧環(huán)境所造成的ROS的大量產(chǎn)生，結(jié)果表明ROS的生成量有所降低，且隨時間改變更加明顯，同時AQP1表達量隨ROS生成量的降低而下降，差異有顯著性(P＜0.05)。③利用特異性AQP1-慢病毒感染HUVEC細(xì)胞使AQP1過量表達，應(yīng)用Western-Blot法驗證，結(jié)果表明，AQP1過表達組較各對照組細(xì)胞AQP1表達顯

6、著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。④HUVEC細(xì)胞過表達AQP1后，應(yīng)用30μmol/L IA刺激細(xì)胞，模擬線粒體低氧環(huán)境，DCFH-DA檢測ROS的產(chǎn)生量與正常細(xì)胞相比產(chǎn)生量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。⑤利用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)特異敲除Balb/c3T3細(xì)胞中的AQP1，同時應(yīng)用Western-Blot驗證表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。應(yīng)用30μmol/L IA處理AQP1敲除的細(xì)胞，顯微鏡下觀察處理4

7、h后的細(xì)胞形態(tài)可見細(xì)胞明顯變圓、皺縮，此時檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ的表達，與對照組相比有顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。6h后觀察細(xì)胞大量死亡同時檢測LC3-Ⅱ的表達與4小時相比，差異沒有顯著性(P＞0.05)。
　　結(jié)論：⑴應(yīng)用IA導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生，應(yīng)用抗氧化劑NAC拮抗IA所導(dǎo)致的ROS的大量產(chǎn)生，結(jié)果表明AQP1的表達量與ROS的增減成正相關(guān)，進一步說明AQP1對內(nèi)源性ROS有轉(zhuǎn)運作用。⑵利用特異性AQ

8、P1-慢病毒感染HUVEC細(xì)胞使細(xì)胞過量表達AQP1，在IA作用下，AQP1過表達組與正常組相比ROS的生成量顯著降低，結(jié)合實驗1進一步說明AQP1對ROS的轉(zhuǎn)運起著決定性作用。⑶應(yīng)用siRNA技術(shù)可以使Balb/c3T3細(xì)胞AQP1基因沉默，AQP1沉默組與正常組細(xì)胞在加入IA處理后，ROS的生成量有顯著性增加，AQP1沉默組自噬的改變與各對照組相比有顯著性差異，且發(fā)現(xiàn)隨時間的變化各時間組自噬改變也有明顯的差異，而正常細(xì)胞自噬隨藥物處