ROS效應蛋白Nrf2介導α-珠蛋白穩(wěn)定蛋白(AHSP)在β-地貧狀態(tài)下的反饋升高.pdf

1、地中海貧血是人類最為常見的單基因遺傳性疾病之一。當珠蛋白基因發(fā)生突變時，一種或多種珠蛋白肽鏈的合成受阻，最終導致α-珠蛋白肽鏈和β-珠蛋白肽鏈的合成不平衡。游離的珠蛋白肽鏈是強氧化劑，可以催化產生活性氧自由基ROS。ROS的產生可以破壞紅系前體細胞和成熟的紅細胞，嚴重時可導致凋亡。凋亡的紅系前體細胞累積即可導致無效的紅系生成，其癥狀即為貧血。另外，游離的珠蛋白不穩(wěn)定而易發(fā)生沉淀或降解。珠蛋白在紅細胞膜上的沉淀會破壞細胞膜導致溶血性貧血。

2、降解的珠蛋白釋放有毒的血紅素、卟啉和鐵離子等，這些游離的離子也會催化產生ROS。ROS的產生是關于地中海貧血的分子病理學的重要內容。
　　 目前關于地中海貧血的治療主要分為三類，輸血、利用鐵螯合劑去除血液中過量的鐵離子和利用激素進行內分泌調節(jié)等方法是對癥治療，可以在一段時間內減輕地中海貧血的臨床癥狀，但需終生用藥；而通過異體骨髓移植、藥物開啟胎兒型珠蛋白基因的表達和利用抗氧化劑等方法則是從病因出發(fā)，可以在一定程度上改善地中海貧血

3、癥狀，但仍面臨排異反應，藥物毒性等因素的困擾；另外有關地中海貧血基因治療的方法也在艱難探索中。
　　 α-珠蛋白穩(wěn)定蛋白AHSP是新近發(fā)現(xiàn)的α-珠蛋白特異的分子伴侶。AHSP的結構決定其功能，通過結合并穩(wěn)定各種形式的α-珠蛋白，AHSP可以減少ROS的產生，在正常的紅系發(fā)生和地貧發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。以AHSP為靶標，尋找可以預防地貧發(fā)生，緩解或者改善地貧癥狀的藥物是很有前景的地貧治療方案。因此關于AHSP表達調節(jié)的研究顯

4、得尤為重要。
　　 AHSP是作為GATA-1的靶基因被發(fā)現(xiàn)的，GATA-1對AHSP的調節(jié)作用也是最早被詳細闡明的。Gallagher等人通過5’RACE的方法首先鑒定了AHSP啟動子區(qū)的5’端，進一步結合多種實驗手段證明了GATA-1和廣譜的轉錄因子Oct-1在AHSP調控區(qū)的結合位點，以人AHSP啟動子導向的報告基因在轉基因鼠體內特異地在骨髓、脾和網織紅細胞等紅系組織中表達。Pilon等人進一步在細胞和動物水平證明了EKL

5、F對AHSP的轉錄激活作用，同時，EKLF作為染色質調節(jié)子還可以改變AHSP的染色質水平。另有文獻報道表明組蛋白去乙?；敢种苿┖图毎麅鹊蔫F的水平都可以調節(jié)AHSP的表達。細胞內游離的鐵可以通過與鐵調節(jié)蛋白相互作用而去穩(wěn)定AHSP的mRNA的穩(wěn)定性，從而負調節(jié)AHSP在鐵過多狀態(tài)下的表達，加劇α-珠蛋白的不穩(wěn)定性，進而加劇地貧的癥狀。機體內（尤其是病理狀態(tài)下）是否存在其他正調節(jié)AHSP的因素，可以通過促進AHSP的表達而穩(wěn)定游離的α-珠

6、蛋白呢？我們在AHSP啟動子區(qū)預測到小Maf家族成員的識別位點，因此推測CNC-bZIP家族成員NF-E2p45和Nrf2可能調節(jié)AHSP的表達。
　　 CNC-bZIP蛋白家族的成員眾多，包括NF-E2，Nrf1，Nrf2，Nrf3，Bach1和Bach2等，均可以與小Maf家族蛋白形成二聚體。其中，NF-E2與GATA-1、EKLF等同為調節(jié)紅系正常生成的重要轉錄因子，對紅系分化晚期的珠蛋白基因的表達調節(jié)至關重要。而Nrf2

7、主要在細胞氧化應激狀態(tài)及抵抗炎癥等方面發(fā)揮重要的調節(jié)作用，可以調節(jié)大量參與細胞保護的基因。
　　 我們首先檢測了AHSP在14.5天胎鼠的不同組織中的表達情況以及在紅系不同分化階段的表達情況。我們以Hemin誘導的K562細胞模擬紅系分化早期階段，以DMSO誘導的MEL細胞模擬紅系分化的晚期階段。結果表明，AHSP在胚胎期的表達主要集中在紅系發(fā)生的特異組織胎肝，并且在細胞系中AHSP與α-珠蛋白的表達均隨著紅系分化程度的增加而升

8、高。在我們的實驗體系里證明了AHSP作為紅系特異蛋白的表達特點。
　　 我們進一步設計實驗考察NF-E2p45和Nrf2對AHSP的調節(jié)作用。首先通過在MEL細胞亞型DS19細胞中干擾Mafk的方法檢測其對AHSP的影響。在Mafk干擾的情況下AHSP的表達顯著升高。提示我們Mafk的確可以調控AHSP的表達，但在細胞未被誘導情況下，Mafk募集轉錄抑制復合物，起抑制AHSP表達的作用。然后我們分別考察NF-E2p45和Nr2

9、對AHSP的調節(jié)作用。過表達和干擾NF-E2p45可以引起AHSP表達的上調和下調，說明NF-E2p45對AHSP存在正向調節(jié)作用；熒光素酶報告系統(tǒng)和ChIP證明NF-E2p45可以通過直接與AHSP調控區(qū)結合而在轉錄水平調節(jié)其表達。Nrf2與NF-E2p45得到相似的結論。以Nrf2特異性激活劑tBHQ和DEM處理K562細胞后，AHSP的表達顯著上調；過表達和干擾Nrf2后AHSP相應地上調和下調；熒光素酶報告系統(tǒng)和ChIP進一步證

10、明了Nrf2對AHSP的正向調節(jié)作用是發(fā)生在轉錄水平的。
　　 新的調節(jié)機制在怎樣的細胞狀態(tài)下發(fā)揮調控功能呢？我們通過在人慢性髓白血病K562細胞系中篩選過表達α-珠蛋白的穩(wěn)定混合克隆株構建了模擬β-地中海貧血的細胞模型。首先通過WB的方法檢測α-珠蛋白的表達情況，證明我們成功得到了過表達的穩(wěn)定株。然后，細胞經DCFH-DA探針標記后通過流式細胞儀檢測ROS的釋放情況。由于α-珠蛋白更傾向以不穩(wěn)定的單體形式存在，而β-珠蛋白可以

11、自身形成相對穩(wěn)定的二聚體或者四聚體，所以一般情況下游離的α-珠蛋白產生的ROS更多，β-地貧的癥狀也更嚴重。我們的分析結果也顯示，過表達α-珠蛋白的細胞株比過表達β-珠蛋白以及過表達空載體的細胞株釋放更多的ROS，與預期結果一致，說明我們構建的模型可以模擬β-地貧狀態(tài)。文獻報道表明Nrf2可以被ROS激活而調節(jié)下游靶基因的轉錄，因此我們進一步檢測了細胞模型中Nrf2的激活情況和AHSP的表達情況。免疫熒光結果表明，過表達α-珠蛋白的K5

12、62穩(wěn)定株和過表達β-珠蛋白的K562穩(wěn)定株中的Nrf2都發(fā)生入核現(xiàn)象。同時檢測的Nrf2的蛋白水平也顯示，過表達α-珠蛋白的細胞株中Nrf2的表達水平與β-珠蛋白和空載體組相比最高。而在正常情況下胞漿中的Nrf2半衰期很短，與Keapl結合促使其很快經泛素-蛋白酶體途徑降解。Nrf2入核及可經WB檢測到蛋白水平都可以使我們得出結論，細胞模型中的Nrf2被過表達α-珠蛋白產生的ROS激活了。此時分析發(fā)現(xiàn)，地貧細胞模型中AHSP的表達在蛋

13、白水平和RNA水平也都被上調了。為了證明AHSP的表達升高的確是由Nrf2引起的，我們進一步干擾了細胞模型中Nrf2的表達，Nrf2干擾造成地貧細胞模型中AHSP的表達不再上調，說明Nrf2是游離α-珠蛋白調節(jié)AHSP的關鍵蛋白。而此時檢測NF-E2p45的表達并未發(fā)生改變，可以部分說明NF-E2p45在這個過程中沒有發(fā)揮主要作用。結合已有的文獻報道，我們的結果表明，在β-地貧狀態(tài)下細胞內存在一個保護性的反饋環(huán)路：游離的α-珠蛋白通過釋

14、放ROS激活Nrf2信號通路，Nrf2引起AHSP的上調，AHSP表達升高后可以穩(wěn)定游離的α-珠蛋白本身。
　　 雖然內在反饋環(huán)路的存在可以相對降低地貧的發(fā)生幾率或者相對緩解地貧的癥狀，但是當機體已經出現(xiàn)嚴重地貧表型時，僅有內在的反饋環(huán)路是顯然不夠的，我們還需要利用外在手段通過給藥等途徑治療地貧。Nrf2特異性激活劑tBHQ是一種強抗氧化劑，已有報道表明抗氧劑可以在細胞水平緩解紅細胞的氧化狀態(tài)，那么，tBHQ是否可以用于地貧的治

15、療呢？我們的結果表明tBHQ不僅在細胞水平，還可以在動物水平升高AHSP的表達，從而增強其對α-珠蛋白的穩(wěn)定作用，并且在地貧細胞模型中tBHQ處理可引起AHSP的表達在內源性反饋增加的基礎上進一步提高。提示了tBHQ作為潛在的治療地貧藥物的可能性。
　　 綜上所述，我們的結果首次證明了NF-E2p45和Nrf2對AHSP的調節(jié)作用；第一次提出并證明了地貧狀態(tài)下機體內存在內在的保護性反饋環(huán)路；并提示抗氧化劑tBHQ可以通過上調AH